[发明专利]一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医药领域。更具体地，本发明涉及一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白、其制备方法及应用。该融合蛋白体内半衰期显著延长，其疗效优于现有的人促卵泡激素。 

背景技术

目前，世界范围内不孕症率高达15％，成为继癌症和心脑血管疾病之外，严重影响人类健康的第三大疾病。我国不孕症人数占生殖妇女人数10％以上，且其发病率呈明显上升趋势。人促卵泡素(Human follicle-stimulating hormone，简称hFSH)是目前市场常见的用于治疗男女不孕症药物的主要成份，我国目前市场包括人尿来源的FSH药物和重组FSH。 

尿源hFSH存在病毒污染、原料来源有限、采集困难、含量低及纯化过程复杂等问题，欧美等发达国家普遍不接受尿源产品上市和销售。相比而言，重组hFSH在其纯度、抗原性、安全性、无病毒感染等方面具有尿源hFSH无法比拟的优点。hFSH是一种糖基化蛋白，SDS-PAGE检测其分子量为43KD。作为一种治疗药物，保证其生物活性，必要的条件是具有正确的三维结构和糖基化修饰。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多药物已投放市场，如EPO、G-CSF等。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。 

虽然目前已有利用CHO细胞生产的重组药物hFSH上市，但仍然存在如下问题：首先，其半衰期短，临床上为了达到有效的治疗效果，需要频繁给药，给患者带来极大痛苦。例如，当用于排卵时，患者必须每日1-2次肌肉内或皮下注射hFSH，通常需要注射8-12天甚至更长时间。这种治疗方案常伴有不良的副作用，包括对神经、内分泌和免疫系统的刺激和毒副作用，并导致常见的并发症如卵巢过度刺激综合征，表现为卵巢增大、全身毛细血管通透性增加和腹水形成，重者可危及患者生命。其次，目前重组hFSH表达量低，制备过程复杂和生产成本巨大。另外，hFSH是具有两条单链(α链和β链)的糖基化蛋白，链间以非共价键连接，两条链的正确折叠才能保证hFSH的生物活性。如何在蛋白表达和纯化过程中保持两条链的正常结合是一个挑战。针对现有重组hFSH及同类产品的缺陷，本发明利用优化的分子生物学技术、细胞生产和纯化工艺开发新型的重组hFSH产品，以延长半衰期、保持其生物活性、提高重组hFSH蛋白表达水平，从而增加其药效、降低副作用。 

发明内容

本发明旨在提供一种重组人促卵泡激素融合蛋白(Human follicle-stimulating hormone-Fc fusion protein，简称hFSH-Fc)、其制备方法及应用，以解决现有技术中重组hFSH表达量低、纯化难、体内半衰期短的问题。 

本发明的一个目的是提供一种重组hFSH-Fc融合蛋白，该融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含hFSHβ亚基、CTP、hFSHα亚基、肽接头(Linker，简称L)和人IgG2Fc变体(vIgG2Fc)，如SEQ ID NO：2所示(hFSHβ-CTP-hFSHα-L-vIgG2Fc氨基酸序列)，上述融合蛋白简述为hFSH-Fc。 

所述的hFSHβ亚基的氨基酸序列去除了常规hFSHβ亚基中的1-18位氨基酸残基，如SEQ ID NO：5所示。 

所述的CTP(carboxy-terminal peptide，羧基端肽)的氨基酸序列来自HCGβ链羧基末端的28-34个氨基酸残基，优选CTP为来自HCGβ链羧基末端的33个氨基酸残基序列，如SEQ ID NO：4所示。 

所述的hFSHα亚基的氨基酸残基序列去除了常规hFSHα亚基中的1-24位氨基酸残基，如SEQ ID NO：3所示。 

所述的肽接头含有2-20个氨基酸残基，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，优选的肽接头氨基酸序列为 

GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。 

所述的人IgG2Fc变体为含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域。