[发明专利]一种长效重组促卵泡激素及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和兽药领域。更具体地，本发明涉及一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白、其制备方法及应用。该融合蛋白体内半衰期显著延长，其在动物繁殖领域中的疗效优于现有促卵泡激素产品。

背景技术

促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，简称FSH)是动物繁殖领域常用的药物主要成分，现有上市FSH主要为猪垂体中提取的生化品种，可用于青年母猪提前发情和同期发情、及超期不发情母猪促发情，在牛和羊繁殖领域也有更广泛的应用。生化提取的FSH存在病毒污染、原料来源有限、采集困难、含量低及纯化过程复杂等缺陷。另外，因检测方法及病毒灭活技术的局限性以及一些不可预知的新致病病毒感染时有发生，并不能完全杜绝生化提取产品发生病毒污染的可能性。

相比而言，重组FSH在其纯度、抗原性、安全性、无病毒感染等方面具有生化FSH产品无法比拟的优点。迄今为止，还未有重组FSH产品用于兽药领域。FSH是一种糖基化蛋白，SDS-PAGE检测其分子量为43KD。另外，hFSH是具有两条单链(α链和β链)的糖基化蛋白，链间以非共价键连接，两条链的正确折叠才能保证hFSH的生物活性。如何在蛋白表达和纯化过程中保持两条链的正常结合是一个挑战。作为一种治疗药物，保证其生物活性，必要的条件是具有正确的三维结构和糖基化修饰。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。

不同哺乳动物种属之间的FSH蛋白的氨基酸序列同源性很高，例如，人FSHα链和β链与猪FSHα链和β链的氨基酸序列同源性分别为83％和96％，人FSH与牛FSH的氨基酸序列同源性高达88％，提示hFSH在其他哺乳动物繁殖领域的潜在应用。目前已有利用CHO细胞生产的人用药物重组hFSH(Human follicle-stimulating hormone，简称hFSH)上市，但仍然存在如下问题：首先，现有方法生产的重组hFSH表达量太低，制备过程复杂，生产成本太高；其次，其半衰期短，需要频繁注射给药。因此，利用分子生物学和细胞培养方法，开发具有生物活性和更长半衰期的hFSH药物是本领域的一个挑战。

发明内容

本发明旨在提供一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白(Human follicle-stimulating hormone-Fc fusion protein，简称hFSH-Fc)、其制备方法及应用，该重组hFSH-Fc融合蛋白应用于动物繁殖领域，与现有生化提取产品相比，体内半衰期更长、药效更好。

本发明的一个目的是提供一种重组hFSH-Fc融合蛋白，该融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含hFSHβ亚基、CTP、hFSHα亚基、肽接头(Linker，简称L)和人IgG2Fc变体(vIgG2Fc)，如SEQ ID NO：2所示(hFSHβ-CTP-hFSHα-L-vIgG2Fc氨基酸序列)，上述融合蛋白简述为hFSH-Fc。

所述的hFSHβ亚基的氨基酸序列去除了常规hFSHβ亚基中的1-18位氨基酸残基，如SEQ ID NO：5所示。

所述的CTP(carboxy-terminal peptide，羧基端肽)的氨基酸序列来自HCGβ链羧基末端的28-34个氨基酸残基，优选CTP为来自HCGβ链羧基末端的33个氨基酸残基序列，如SEQ ID NO：4所示。

所述的hFSHα亚基的氨基酸残基序列去除了常规hFSHα亚基中的1-24位氨基酸残基，如SEQ ID NO：3所示。

所述的肽接头含有2-20个氨基酸残基，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，优选的肽接头氨基酸序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。

所述的人IgG Fc变体为含有Pro33lSer突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域。

以下具体介绍本发明的人IgG Fc变体、肽接头和CTP功能：

IgG Fc变体