[发明专利]一种从淡水珍珠蚌肉中提取胶原蛋白的工艺方法

说明书

技术领域

本发明涉及从淡水双贝壳类动物体中制取胶原蛋白的方法工艺，尤其涉及从珍珠蚌斧足中提取胶原蛋白的工艺方法。

技术背景

珍珠蚌是瓣鳃纲软体动物，其外壳长可达200mm，外形呈角突卵圆形，两壳膨胀，喜生活在淤泥底及水流缓慢、静止的水域中，常在湖泊、河流、水库、池塘内可见，肉可以吃，同常被用作禽类的天然饵料及饲料。

胶原蛋白是一种生物性纤维类高分子蛋白，白色、不透明、无支链，在哺乳动物及水生动物的皮、骨、鳞片、软骨、韧带、肌腱等大量存在，大约有18-19种，根据其来源总共可分为四类胶原蛋白：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型。Ⅰ型胶原是从皮肤和骨骼中提取得到的，Ⅱ型胶原是从软骨组织中分离得到的，Ⅲ型胶原是从胚胎中分离得到的，Ⅳ型胶原是从细胞底膜中分离提取得到的。

胶原蛋白是一种结构性蛋白，由三股右手螺旋的多肽链盘绕折叠形成一种右手螺旋结构，即由甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸、甘氨酸-脯氨酸-Y、甘氨酸-X-Y这些3肽的重复片段折叠形成。经过酸、碱、酶的处理后这些三螺旋结构就会松开，分成三条肽链，从而利于胶原蛋白的提取。胶原蛋白具有一般蛋白质的化学性质，能发生氨基反应、羧基反应、呱基反应、甲硫基反应、羟基反应、显色反应，与金属离子及表面活性剂作用等。

胶原蛋白是一种功能性蛋白质，具有高度抗张能力，在动物细胞中起结缔组织的作用，在生物学功能方面，促进伤口愈合、止血、骨骼愈合，增强皮肤代谢等。当免疫蛋白与胶原蛋白结合时，可以显著提高人体的免疫机能。目前胶原蛋白的主要来源为陆生动物，如猪、牛、羊等，但随着胶原蛋白需求量的增加以及各种禽类疾病的爆发，人们对陆生动物胶原蛋白的使用安全问题产生了怀疑，现有的胶原蛋白已不能满足现代人对胶原蛋白产量及质量的要求，所以寻找新的胶原蛋白来源，成为当今社会胶原蛋白行业普遍关注的问题，而我国水产资源丰富，从水生动物体内提取胶原蛋白成为胶原蛋白的主要来源。河蚌在平常水域中经常可见，特别是珍珠蚌养殖量大，取珠后的珍珠蚌经常随意丢弃或成为家禽的天然饲料，这样不仅造成了环境污染而且造成了极大的浪费，如果从蚌肉中提取胶原蛋白，不仅减少了环境污染还可以提高珍珠蚌的利用价值，因此从珍珠蚌中提取胶原蛋白是值得探索和有意义的。

发明内容

本发明涉及一种从淡水珍珠蚌中提取胶原蛋白的工艺方法，充分利用了蚌肉，提高了珍珠蚌的附加值。

本发明是这样来实现的，所述工艺方法包括下述步骤：

一种从淡水珍珠蚌肉中提取胶原蛋白的工艺方法，所述工艺方法包括以下步骤：

a、原材料制备：（1）将淡水珍珠蚌肉放在-80℃冰箱中冷冻24h；（2）将冷冻后的蚌肉在冷冻干燥箱中冷冻干燥，直到去除表面水分为止；

b、原材料的预处理：（1）将冷干后的蚌肉切碎，在50倍体积的预处理液中去除脂肪及内源性胶原蛋白，维持恒定温度为4-8℃；（2）用20mM Tris-HCl, pH 8.0的溶液浸泡24h,每8h更换一次浸泡液；（3）将Tris-HCl处理后的原料用0.1M NaOH浸泡24h，每8h更换一次浸泡液；（4）将经NaOH处理后的原材料经滤网过滤，然后用超纯水充分洗涤过滤后的蚌肉，然后过滤，直到滤液呈中性或微碱性为止，最后一次水洗后，用冷冻离心机离心，12000r/min, 20min, 4℃，去掉上清液，得到沉淀；

c、酶解-超声波破碎：将预处理后的蚌肉溶解在0.5M的醋酸溶液中，按照胃蛋白酶与冷干的蚌肉的质量比3:100的配比，加入胃蛋白酶，在室温下，用超声波处理此溶液，采用处理30min,暂停30min 的方式，连续处理2d；

d、分离：将得到的超声破碎液用冷冻离心机离心，得到上清液；

e、二次提取：将离心所得的沉淀再次用c步骤所述方法超声破碎提取，离心，取得上清液，将沉淀去掉；

f、合并：将两次离心所得上清液合并在一起；

g、提纯：向上清液中加入2M的NaCl溶液，使上清液中NaCl的最终浓度为0.9M，并在4℃冰箱中静置过夜；

h、二级分离：将上述溶液高速冷冻分离，所得沉淀即为初步纯化的胶原蛋白沉淀；

i、透析：将得到的沉淀溶解于0.5M 醋酸溶液中，在4℃下用去离子水透析3天。

j、离心：将透析后的溶液高速冷冻离心，12,000r/min, 30 min, 所得沉淀为最后纯化的胶原蛋白。

k、冷冻干燥：将取得的纯的胶原沉淀冷冻干燥处理，在-80℃的冰箱中保存。