[发明专利]一种杏抗寒基因转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种杏抗寒基因转化的方法，尤其涉及杏的一种花粉管导入进行基因转化的方法，属于生物技术和现代农业技术领域。

背景技术

低温是限制植物生长、发育及其地理分布的一个重要因素。植物冻害会给农业、种植业造成很大的经济损失。据统计在我国大约每十年左右就发生一次周期性的冻害，常发生的冻害种类包括越冬作物冻害、果树冻害和经济林木冻害等。相比之下，农作物、蔬菜、花卉冻害只影响当年，而对果树和经济林木的冻害不仅对当年造成巨大损失，而且受冻害之后多年内会持续受到影响。杏(Armeniaca vulgaris Lam.)系蔷薇科(Rosaceac)杏属植物，原产于我国，种质资源极为丰富，是中国栽培历史最久的果树之一，但由于春季低温和晚霜，常使花芽、花，甚至幼果受冻，产量和经济效益受到极大的损失，因此选育抗寒性强的品种有重要意义。

近十几年来，国内外迅速发展的转基因技术已经在果树育种中得到了广泛的应用，并且已经取得了长足发展，转基因技术已经成为果树品种改良最有前途的技术方法之一。花粉管导入法在农作物上取得了令人鼓舞的成绩，但是在果树上应用的研究却极少，由于果树育种周期长，不断地摸索试验快速有效的育种方法是很有意义的。但由于春季低温和晚霜，常使花芽、花，甚至幼果受冻，产量和经济效益受到极大的损失。由于果树的继代繁殖周期长，基因型多为杂合型，杂交后代会产生复杂多样的分离，需要大量的回交才能除去不需要的性状，利用传统的抗性育种杂交法改良果树的抗性就需要很长的时间，而且要把许多优良性状集中在一个果树品种上是非常困难的。近些年来，国内外迅速发展的转基因技术(transgenic technigues)已经在果树育种中得到了广泛的应用，并且已经取得了长足发展，转基因技术已经成为果树品种改良最有前途的技术方法之一。

1988年第一株转基因核桃(Juglans regia L.)在美国诞生，为利用基因工程改变果树特定性状、培育果树新品种奠定了实践基础。随后转基因技术迅速发展，目前，我国已在荔枝、番木瓜、苹果、柑橘、梨、桃、香蕉、猕猴桃、葡萄、樱桃、草莓的果树上展开了遗传转化技术的研究，转化方法主要包括农杆菌介导法和基因枪轰击的方式，获得了部分转基因植株。在果树等林木育种中，花粉管通道法的相关研究少有报道，仅见钟启宏等采用花粉管通道导入方法，将欧洲黑杨的一个克隆片段导入泡桐，最终获得了3株可含50μg/mL的Kan培养基上生长的幼苗。侯立群(2000)等利用花粉管通道法进行核桃转基因研究，只是获得了畸形果植株，但尚未完成分子鉴定等。花粉管通道法进行转化的供体可以是植物总DNA，即利用自然界现有的具目的性状的外源DNA或基因进行遗传转化，其实质相当于远缘杂交。因此，利用植物总DNA的花粉管通道法进行果树遗传转化，可不必担心由其它转化系统获得的转基因植物的生态风险性等问题。目前，在转基因中所应用的农杆菌介导、基因枪等方法，主要通过建立组织培养体系实现基因导入，转基因受遗传转化体系限制较大，甚至一个无性系就需要建立一套转化体系，很难实现多基因型受体的遗传转化与筛选。花粉管通道导入法可以克服其它转化方法对组织培养的依赖，以及因组织培养限制而产生的转化基因型单一等问题，直接形成大量的种子，并且由于导入的是全组DNA，本身带有多种基因，故获得的变异后代群体遗传多样性丰富，选择余地大。随着有关研究的深入以及技术的日益完善，花粉管通道法也必将在果树育种领域发挥更大的作用。

目的基因沙冬青抗寒基因AmEBPl由中国科学院遗传发育所王斌研究员实验室与山东泰山林科院共同构建并提供。该基因采用分子克隆方法(cDNA-AFLP和RACE)从内蒙古沙漠中的常绿抗寒木本植物沙冬青中克隆。AmEBPl基因是国内外第一个木本植物抗冻肽调节基因，基因的编码序列全长1188个核苷酸，它编码395个氨基酸和一个终止密码子(TGA)。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的在于利用花粉管通道法成功转化杏抗寒基因，获得转基因植株，以期提高杏树抗寒特性，同时丰富抗寒杏的新种质资源。

为实现上述目的，本发明技术方案如下：

一种杏抗寒基因转化的方法，是采用花粉管导入转化杏抗寒基因的方法，其步骤包括：(1)提取质粒DNA；(2)采集与处理待授粉的花粉；(3)利用含有目的基因的花粉对受体进行杂交授粉；(4)获得与扩繁转基因植株；(5)检测转基因杏组培苗分子。其中：