[发明专利]一种香豆素衍生物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及香豆素衍生物，具体是2,2-二氰基-3-（7-羟基-4-香豆素基）环氧乙烷的制备方法及其作为荧光探针在检测生物体内半胱氨酸中的应用。

背景技术

氨基酸是构成生物体蛋白质并与生命活动有关的最基本的物质,与生物的生命活动有着密切的关系。半胱氨酸作为人体必须的氨基酸之一,是参与蛋白质合成的20种氨基酸中的一种,同时也是构建重要的谷胱甘肽的三个氨基酸之一；而高半胱氨酸为甲硫氨酸代谢的中间产物,本身不参与蛋白质的合成,体内高半胱氨酸含量的大小与许多疾病相关联。现代医学研究表明,细胞内高半胱氨酸的表达与心血管疾病有直接关联。因此,研制高选择性地识别半胱氨酸和高半胱氨酸荧光探针并实现其在活细胞中的荧光成像具有十分重要的意义。

近几年来，人们开始关注设计合成对半胱氨酸具有特异性响应的荧光探针，并合成了几类有机荧光探针，具有代表性的主要有：香豆素类，罗丹明类，荧光素类,荧光染料BODIPY,萘腙衍生物，本探针化合物与半胱氨酸作用后，荧光强度显著增强，其他一些常见氨基酸几乎没有显著地荧光响应。因此本发明可以作为选择性检测生物体内半胱氨酸的荧光探针，也可用于荧光标记细胞内半胱氨酸，为临床医学中相关疾病的诊断提供帮助。

发明内容

 发明的目的在于提供一种香豆素衍生物及其制备方法，该化合物可用于生物体内半胱氨酸的检测，也可用于细胞内半胱氨酸的荧光标记。

本发明提供的一种香豆素衍生物，其结构式如下：

本发明提供的一种香豆素衍生物的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备4-氯甲基-7-羟基香豆素，可根据文献J.Med.Chem.2007,50,5848-5852合成；

（2）用4-氯甲基-7-羟基香豆素制备4-羟甲基-7-羟基香豆素，可根据文献J.Med.Chem.2007,50,5848-5852合成；

（3）用4-羟甲基-7-羟基香豆素制备7-羟基香豆素-4-甲醛，可根据文献J.Med.Chem.2007,50,5848-5852合成；

（4）按质量比1︰5～10将7-羟基香豆素-4-甲醛加到水中，再加入1～2倍7-羟基香豆素-4-甲醛摩尔量的丙二腈和0.1～0.3倍7-羟基香豆素-4-甲醛摩尔量的1-甲基咪唑，室温搅拌反应12小时，过滤得2,2-二氰基-3-（7-羟基-4-香豆素基）环氧乙烷。

本发明制备的2,2-二氰基-3-（7-羟基-4-香豆素基）环氧乙烷可以作为选择性检测生物体内半胱氨酸的荧光探针，也可用于荧光标记细胞内半胱氨酸，为临床医学中相关疾病的诊断提供帮助。

与现有技术相比，本发明作为选择性检测生物体内半胱氨酸的荧光探针有如下优点：探针化合物与半胱氨酸作用后，荧光强度显著增强，其他一些常见氨基酸几乎没有显著的荧光响应。

附图说明

图1本发明化合物对氨基酸的选择性识别测试。

图2半胱氨酸对本发明化合物荧光滴定。

图3半胱氨酸工作曲线。

图4半胱氨酸对本发明化合物紫外滴定。

图5高半胱氨酸对本发明化合物荧光滴定。

图6高半胱氨酸对本发明化合物紫外滴定。

图7谷胱甘肽对本发明化合物荧光滴定。

图8谷胱甘肽对本发明化合物紫外滴定。

图9本发明化合物对细胞内半胱氨酸的荧光成像：（a）PBS缓冲液中细胞的自发荧光成像；（b）与探针化合物共孵育30分钟后细胞的荧光成像。

具体实施方式

实施例1香豆素衍生物的制备

（1）在100mL的反应瓶中，加入50mL浓硫酸，用冰水浴冷却至0℃，开动搅拌，加入5.5g（50mmol）间苯二酚，然后滴加6.8g（41.3mmol）4-氯乙酰乙酸乙酯，控制滴加速度使反应体系的温度保持在0±2℃，加完后室温搅拌反应过夜。将反应液倒入冰水中，析出白色固体，过滤，水洗，干燥得6.9g4-氯甲基-7-羟基香豆素，收率79.4%。

（2）在2L的反应瓶中，加入6.9g（32.8mmol）4-氯甲基-7-羟基香豆素和900mL水，加热回流反应36小时，冷却，析出白色固体，过滤，用水洗涤，干燥得5.9g4-羟甲基-7-羟基香豆素，收率93.7%。