[发明专利]一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT、其编码的氨基酸序列以及克隆方法

权利要求书

1.一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT，其特征在于，淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT编码的蛋白质对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种权利要求1所述的淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）选用淡水小龙虾作为实验材料，利用动物总RNA提取试剂盒提取各组织总RNA，获得淡水小龙虾各个组织的总RNA样品；

（2）以步骤（1）获得的总RNA样品作为模板，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾各个组织的cDNA样品；

（3）设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT编码区的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R：

Pc-MT-F：5′-TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3′

Pc-MT-R：5′-TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3′

以步骤（2）中的淡水小龙虾各个组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；

（4）将步骤（3）获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR Ⅰ核酸内切酶和Xho Ⅰ核酸内切酶的双酶切处理，并且与经过EcoR Ⅰ核酸内切酶和Xho Ⅰ核酸内切酶双酶切处理的pET-28a大肠杆菌质粒载体连接，转化大肠杆菌DH5α克隆菌株感受态细胞之后，进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行序列测定，获得淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT基因序列。

（5）将步骤（4）获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件（http://au.expasy.org）进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列。