[发明专利]一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物及其制备，属于生物医药技术领域。

背景技术

超氧化物歧化酶（SOD)是一类重要的超氧阴离子自由基清除剂，可用于防治过量超氧阴离子自由基引起的疾病和机体损伤，如辐射损伤、缺血再关注损伤、自身免疫性疾病等。但天然来源的超氧化物歧化酶存在有一定的抗原性、体内半衰期短和稳定性差等缺点，限制了其应用。对其分子进行化学修饰是克服超氧化物歧化酶缺点的有效方法，常采用的修饰剂有聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、低分子肝素、壳聚糖等，修饰后的SOD免疫原性降低、体内半衰期延长、稳定性增加。

壳聚糖是目前发现的自然界存在的唯一一种阳离子多糖，具有清除自由基，抗炎等作用，季铵化能改善其水溶性并进一步提高其带正电荷的能力。Liu JF等（参见Journal of drug targeting,2009.17(3):216-224.）采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)缩合法使季铵化壳聚糖（TMC）的自由氨基与SOD分子的羧基形成酰胺键得修饰产物，研究表明TMC修饰的SOD衍生物具有稳定性高、体内半衰期长和显著的细胞靶向性等优点，是一种有研究和开发价值的SOD衍生物。

但由于SOD分子羧基数量较少导致反应效率较低，同时修饰物活性保持率不够高，制约了季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶（TMC-SOD）修饰物，并提供该修饰物的制备方法。

术语说明

自由氨基：伯胺基团（即—NH₂）,亦称一级胺基。

季铵化壳聚糖：壳聚糖的葡萄糖胺的自由氨基全部或部分被季铵基团（—N(CH₃)₃⁺）取代得到的衍生物。

本发明的技术方案如下：

一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，是超氧化歧化酶（SOD）分子上的自由氨基与季铵化壳聚糖（TMC）分子的氨基通过二硫键结合，一分子超氧化歧化酶（SOD）与1～20分子铵化壳聚糖（TMC）结合，结构式如下：

-SOD-S-S-(TMC)n；

式中，n=1～20；SOD的分子量为32000Da；TMC的分子量为2000Da以上，自由氨基摩尔含量为5%～80%。

优选的，所述n=1～6，即一分子SOD与1～6分子TMC共价结合形成修饰物；TMC的分子量为5000Da～100000Da，自由氨基摩尔含量为15%～50%。

一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的制备方法，包括如下步骤：

（1）称取季铵化壳聚糖（TMC）溶于10mM PBS缓冲液，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得季铵化壳聚糖溶液，加入3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP），使季铵化壳聚糖中自由氨基与3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为（1～100）∶1，震荡反应，除去未反应的3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和中间产物，制得TMC功能化产物；

（2）将超氧化歧化酶溶于10mM PBS缓冲液，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得超氧化歧化酶溶液，加入3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP），使超氧化歧化酶与3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1∶（0.1～50），震荡反应，除去未反应的3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和中间产物，制得活化的SOD；

（3）取步骤（1）制得的TMC功能化产物溶液，加入二硫苏糖醇（DTT），室温震荡反应，除去过量的二硫苏糖醇和中间产物，得到巯基活化的TMC（TMC-SH），然后，加入步骤（2）制得的活化的SOD，使TMC功能化产物与活化的SOD的摩尔比为（0.5～20）∶1，置于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，0～60℃保温反应1h～48h，经纯化后，制得季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物。

所述的TMC可按照现有技术制备。如参见Eur J Pharm Biopharm，2004，57:77-83，具体制备方法如下：