[发明专利]利用草坪草-微生物联合修复镉污染土壤的方法

权利要求书

1.一种利用草坪草-微生物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于包括下列步骤：

①耐镉狗牙根的筛选，获得耐镉性强的狗牙根材料；

②污染地区狗牙根根际土壤的采集；

③耐镉微生物的筛选，获得耐镉性最强的微生物为真菌-棘孢曲霉；

④微生物修复基质制备；

⑤草坪草-微生物联合修复。

2.按权利要求1所述的一种利用草坪草-微生物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于步骤①耐镉狗牙根的筛选：

选取中科院武汉植物园草坪种质资源圃保存的耐逆性强、再生性好、适应性广的狗牙根材料，在温室可控条件下，1/2Hoagland营养液水培2个月，待根系和冠层基本建成，各种质材料生长一致时，进行梯度浓度镉胁迫处理，梯度浓度从0.2mM开始，每次增加0.1mM直至1.5mM，每周对草坪质量进行打分，测定冠层生长速率及光化学效率，采用模糊数学中隶属函数法，评价狗牙根的耐镉能力，根据评价结果，获得耐镉性强的狗牙根材料。

3.按权利要求1所述的一种利用草坪草-微生物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于步骤②污染地区狗牙根根际土壤的采集：

根据湖南株洲地区土壤调查及工厂排污口所处位置，确定污染土壤采集点，在污染源周边等距离设置5个重复采样点，利用不锈钢工具采集狗牙根根际土壤，将5个重复采样点土壤充分混合均匀后于荫凉处过2mm不锈钢筛，去除动植物残体，装入塑料自封袋中低温冷冻保存，运至实验室进行耐镉微生物分离。

4.按权利要求1所述的一种利用草坪草-微生物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于步骤③耐镉微生物的筛选:

选取10g重金属污染区优势植物-狗牙根根际土壤置于三角瓶中，无菌条件下，加入适量玻璃珠和90ml无菌水，在旋转式摇床150rpm、30℃振荡30min，以使微生物从土壤中充分洗脱，然后静置20min，吸取上清液用无菌水稀释100倍，即为土壤菌悬液；   

筛选耐镉微生物所需的培养基为添加不同浓度CdSO₄的固体培养基：

A、牛肉膏蛋白胨培养基主要成分为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂18g，加水稀释至1L，调整pH为7.0-7.2；

B、马丁氏琼脂培养基主要成分为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄、7H₂O 0.5g，琼脂18g，加水稀释至1L，加入1%孟加拉红溶液3.3ml，无需调pH；

C、高氏一号培养基主要成分为：可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，NaCl 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄×7H₂O 0.5g，FeSO₄ 0.01g，琼脂18g，加水稀释至1L，调整pH为7.2-7.4；

配置好的培养基在103kPa，121℃灭菌20分钟，冷却至60℃后倒入无菌培养皿中；在无菌条件下，利用移液枪吸取1ml菌悬液，均匀涂布到镉浓度为50mg/L的固体平板上，待菌落长成后，利用平板划线分离法接种到镉浓度为100、150、200mg/L的固体培养基中，在恒温培养箱中30℃培养，将耐镉能力最强的菌落选出，对其单菌落连续4次采用平板划线分离法进行纯化；经ITS序列测序得出，该耐镉微生物为真菌-棘孢曲霉。