[发明专利]一种阿拉伯呋喃糖苷水解酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于啤酒酿造技术领域，涉及一种阿拉伯呋喃糖苷水解酶及其改善啤酒大麦麦芽过滤性能的方法。

背景技术

大麦麦芽作为啤酒酿造的主要原料，在啤酒酿造中有着举足轻重的作用。而国内部分大麦制得的麦芽与进口优质大麦麦芽相比，品质存在不少缺陷，过滤性能缺陷就是其中之一，如麦芽制得的麦汁过滤困难，易浑浊，浸出率低等，严重制约了其在中国啤酒行业中的应用。

目前市场上针对于麦芽过滤性能缺陷开发出了多种酶制剂，β-葡聚糖内切酶、阿拉伯木聚糖内切酶、蛋白酶是主要成分，但是国内啤酒大麦麦芽的过滤性能仍然没有较明显的改观。发明内容

本发明提供了一种阿拉伯呋喃糖苷水解酶（AXAH）用于提高麦芽汁过滤性能的方法。

是在麦芽糖化过程中加入阿拉伯呋喃糖苷水解酶。

所述阿拉伯呋喃糖苷水解酶添加量为4～8mU/g麦芽。

所述阿拉伯呋喃糖苷水解酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

目前常用于改善麦芽汁过滤性能有多种酶制剂，例如β-葡聚糖内切酶和阿拉伯木聚糖内切酶，但是现有技术中阿拉伯呋喃糖苷水解酶未有应用，因此，阿拉伯呋喃糖苷水解酶还可以与其他常用酶制剂一起改善麦芽汁过滤性能。

为了提高阿拉伯呋喃糖苷水解酶作用效果，优选在糖化的初始阶段进行添加，从而使麦芽制得麦汁的过滤性能得到有效的改善方法。

本发明是在大麦麦芽中分离纯化出阿拉伯呋喃糖苷水解酶（AXAH），包括如下步骤：

（1）大麦麦芽粗酶液的制备。大麦麦芽粉碎，与pH5.0、0.1mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液以1:4～5混合，4℃浸提过夜，离心取上清液，进行硫酸铵分级沉淀，离心弃上清，用pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液复溶沉淀物，将复溶液加到1000Da的透析袋中，pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液透析至无硫酸根离子，离心去除变性蛋白得到粗酶液。

（2）将（1）得到的粗酶液按顺序依次通过阳离子柱、阴离子柱和凝胶柱，使AXAH得到分离纯化。

①阳离子交换柱层析：

填料：HiPrep16/10SP FF；平衡液：pH5.0左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液；平衡体积：100mL；流速4mL/Tub/min；洗脱液：pH5.0左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液（含1mol/L NaCl）；上样：粗酶液，收集穿透峰部分。

②阴离子交换柱层析：

填料：HiPrep16/10Q FF；平衡液：pH5.2左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液；平衡体积：60mL；流速4mL/Tub/min；洗脱液：pH5.2左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液（含1mol/L NaCl），线性洗脱100mL；上样：经阳离子交换柱层析穿透部分，浓缩换缓冲液为pH5.2左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐后上样，收集洗脱峰有酶活部分。

③凝胶柱层析：

填料：HiPrep16/60Sephacryl S-100HR；平衡、洗脱液：pH5.0左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液（含0.15mol/L NaCl）；流速0.5mL/Tub/min；上样：经阴离子交换柱层析吸附有酶活部分，浓缩换缓冲液为pH5.0左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐后上样，收集有酶活峰，并冷冻干燥冻成干粉。

上述的方法在实际操作中可以是：

（1）大麦麦芽AXAH粗提液的制备

取大麦麦芽用EBC-LF麦芽标准粉碎机进行2目粉碎与pH5.0、0.1mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液以1:4～5混合，4℃浸提过夜（中间进行几次搅拌），用离心机10000r/min、离心15min，取上清液，进行硫酸铵分级沉淀，收集硫酸铵饱和度20～40%之间的沉淀，用pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液复溶沉淀物，用排阻1000Da的透析袋透析，pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液透析至无硫酸根离子，离心机10000r/min、离心15min去除变性蛋白，上清即为AXAH粗酶液。