[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌启动子探针载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种谷氨酸棒杆菌启动子探针载体，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体为出发质粒，插入上游不含启动子的报告基因及新抗性基因，同时在报告基因上游的MCS位点前端插入终止子。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体，其特征在于，所述的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体为pXMJ19。

3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体，其特征在于，所述的报告基因为氯霉素乙酰转移酶基因Cm^R。

4.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体，其特征在于，所述的新抗性基因为氨苄青霉素抗性基因Amp^R。

5.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体，其特征在于，所述的终止子为rrnB T1。

6.权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体的构建方法，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体为出发质粒，利用PCR-targeting打靶技术构插入上游不含启动子的报告基因和作为探针筛选标记的新抗性基因，同时在报告基因上游的MCS位点前端插入终止子。

7.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pXMJ19为出发载体，利用PCR-targeting打靶技术以及一步克隆法插入上游不含启动子的报告基因Cm^R和作为探针筛选标记的新抗性基因Amp^R，同时在报告基因上游的MCS位点前端插入终止子rrnB T1。

8.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，分别以载体pUC18和pXMJ19为模板，用下述引物，分别扩增得到片段Amp^R和片段MCS-SD-Cm^R，再以引物Cm^R-F和Amp^R-R进行overlap PCR，获得片段Amp^R-MCS-SD-Cm^R：

Cm^R-F:5’-TCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAG；

Cm^R-R:5’-TGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAAGGGCACCAATAACTGC；

Amp^R-F:5’-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGTGCGCGGAACCCCTATTTGT；

Amp^R-R:5’-AAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGAATTCGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTG。

9.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，通过PCR-targeting技术将扩增得到的Amp^R-MCS-SD-Cm^R片段打靶替换到载体pXMJ19上，得到质粒pSDCAT。

10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，以载体pXMJ19为模板，用下述引物，扩增得到终止子rrnB T1：

rrnB T1-F:5’-GGTTCCGCGCACATGGTACCTAGCGCCGATGGTAGTGTG；

rrnB T1-R:5’-CGACTCTAGAGGATCCCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTC。

11.根据权利要求10或11所述的构建方法，其特征在于，其特征在于，通过酶切位点BamHI和KpnI将载体pSDCAT线性化后，通过一步克隆法构建入终止子rrnB T1，得到启动子探针载体pTSDCAT。

12.权利要求1～6任一项所述的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体在定量筛选谷氨酸棒杆菌不同强度启动子中的应用。