[发明专利]表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌，其特征是，制备方法是:

（1）克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的cDNA，所述木质素过氧化物酶为Ligninase LG3，蛋白序列为SEQ ID NO:01；

（2）用BamH I和Xho I双酶切克隆的上述cDNA，获得相应酶切片段，将酶切片段用T4 DNA连接酶连接pCold-TF载体,得到重组原核表达质粒pCold-TF-LiP；

（3）鉴定重组原核表达质粒pCold-TF-LiP是否阳性表达，得到阳性重组质粒pCold-TF-LiP；

（4）将阳性重组质粒pCold-TF-LiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌。

2.一种表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征是，

（1）克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的cDNA，所述木质素过氧化物酶为Ligninase LG3，蛋白序列为SEQ ID NO:01；

（2）用BamH I和Xho I双酶切克隆的上述cDNA，获得相应酶切片段，将酶切片段用T4 DNA连接酶连接pCold-TF载体,得到重组原核表达质粒pCold-TF-LiP；

（3）鉴定重组原核表达质粒pCold-TF-LiP是否阳性表达，得到阳性重组质粒pCold-TF-LiP；

（4）将阳性重组质粒pCold-TF-LiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌。

3.如权利要求2所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征是，所述cDNA序列为SEQ ID NO:02。

4.如权利要求2所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征是，鉴定重组原核表达质粒pCold-TF-LiP是否阳性表达的方法为：

（一）热击法将重组原核表达质粒pCold-TF-LiP导入至DH5α感受态细胞中；

（二）菌液PCR扩增鉴定，得到阳性克隆的DH5α；

（三）碱裂解法对上述阳性克隆的DH5α提取重组质粒；

（四）重组质粒进行BamH I和Xho I双酶切鉴定，对目的片段进行测序，测序正确的重组质粒为阳性重组质粒pCold-TF-LiP。

5.如权利要求4所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征是，步骤（二）的菌液PCR扩增鉴定使用的正向引物为5’–aactcgagatggcatttaaacagctttttgcgg–3’，反向引物为5’–aaggatcccgctcccggaggcggtgg–3’。

6.如权利要求1所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌在表达木质素过氧化物酶中的应用。

7.如权利要求6所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌在表达木质素过氧化物酶中的应用，其特征是，将表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌接种于含有氨苄青霉素的液体培养基中，培养，加入蛋白诱导剂IPTG，分离提纯，得到表达的木质素过氧化物酶。

8.如权利要求7所述的应用，其特征是，液体培养基为LB液体培养基，氨苄青霉素的浓度为80～120mg/L，培养温度为35～37℃。

9.如权利要求7所述的应用，其特征是，培养至OD₆₀₀为0.58～0.62时加入蛋白诱导剂IPTG，16℃培养。