[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和在γ-氨基丁酸生产中的应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)又叫氨酪酸，属于氨基酸类衍生物，其分子式为C₄H₉NO₂，相对分子质量为103.12。γ-氨基丁酸是一种重要的抑制性神经递质，对哺乳动物具有重要的生理调节作用，如降血压、改善睡眠和抗心率失常等；我国卫生部已经批准γ-氨基丁酸为新资源食品。近年来，γ-氨基丁酸的市场需求与日俱增。

γ-氨基丁酸的合成方法主要由化学合成法和生物合成法。化学合成法，一般分为两种，一种是γ-氯丁氰通过发生取代水反应来合成，将邻苯二甲酰亚氨钾与γ-氯丁氰在180℃反应，然后将产物与浓硫酸回流，再结晶提纯而得；另外一种是毗咯烷酮在氢氧化钙、碳酸氢铵的作用下水解开环制备获得。微生物合成法主要分为直接发酵法和全细胞转化法。利用全细胞转化法生产γ-氨基丁酸，得到的转化液成分相对简单，杂质含量较少，简化后提取分离步骤，降低了生产成本。直接发酵法合成γ-氨基丁酸得到的发酵液成分较复杂，会增加下游分离提取的成本，是γ-氨基丁酸工业化生产的瓶颈问题之一。

化学法虽然具有反应迅速的特点，但是由于该方法副反应较多，且有化学物质残留，即使得到纯品也不属于天然产物，同时，该反应对环境条件要求较为苛刻，且能耗高、危险系数高。与化学法相比，微生物法制备γ-氨基丁酸具有条件温和，安全性较高，生产成本较低等诸多优点。目前，γ-氨基丁酸的生产企业，大都采用微生物法，因此微生物发酵法最具有商业化开发应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一株重组谷氨酸棒杆菌。

本发明要解决的技术问题之二在于提供上述重组菌的构建方法。

本发明要解决的技术问题之三在于提供所述重组谷氨酸棒杆菌在生产γ-氨基丁酸上的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种高产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)NJ-M6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2013486，保藏日期为2013年10月22日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。

具体来说，所述的高产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌，它是导入了来源于节杆菌的谷氨酸脱羧酶基因的谷氨酸棒杆菌。

其中，所述的谷氨酸脱羧酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

上述高产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，它包括如下步骤：

1)构建含有谷氨酸脱羧酶的重组表达质粒；所述重组表达质粒是将谷氨酸脱羧酶基因gad基因插入pXJ19载体，得到重组质粒pXJ19-gad；

2)将步骤1)构建得到的重组质粒转化入谷氨酸棒杆菌（购于中国工业微生物菌种保藏中心CICC，编号为10240），得到产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌。

所述重组质粒为pXJ19-gad，该质粒由以下方法得到：以节杆菌(菌种编号；CGMCC No.3584)基因组为PCR模板，PCR扩增谷氨酸脱羧酶基因，然后构建入载体pXJ19中，得到重组质粒pXJ19-gad.

上述谷氨酸棒杆菌感受态的制备：挑取新鲜平皿上谷氨酸棒杆菌C.glutamicum CICC10240，接种入含0.5%(质量体积比)葡萄糖的2m1液体LB培养基中，30℃,200r/min培养12小时，再按1%(接种量与培养基的体积百分比)接种到含3%(质量体积比)甘氨酸和0.1%(体积比)Tween80的50mL LB中，使起始OD₆₀₀达到0.4，在30℃中继续培养至OD₆₀₀达到0.9。将菌液冰浴20分钟，离心收集菌体，用预冷的10%体积百分比)甘油重悬细胞，用1.5m1离心管分装，每管80uL。将感受态细胞放-70℃冰箱保存或直接用于电击转化。