[发明专利]一种有效抑制甘草细胞悬浮培养初期褐化现象发生的方法

说明书

技术领域：

本发明主要涉及一种有效抑制甘草细胞悬浮培养初期褐化现象发生的方法，属植物细胞培养领域。

背景技术：

甘草(Glyrrhiza uralensis Fisch)，豆科多年生草本或半灌木的植物，世界上最古老也是应用最广泛的中草药之一。近年来随着甘草临床应用量的急剧增加及对甘草开发利用范围的扩大，甘草的需求量和出口量急剧增长，野生甘草资源遭到无节制采挖，直接导致了生态环境的恶化和野生甘草资源的锐减。为解决甘草的供求矛盾，人工甘草种植便成了首要选择。但栽培甘草病害严重；不论产量还是质量都还远不能满足现有的需求，解决甘草资源问题迫在眉睫。

植物细胞培养技术由于具有可持续、可再生、生产周期短以及人工可控等优势，已经成为生产植物次生代谢产物最有希望的途径之一。甘草细胞从固体培养基转移到液体培养基中后，由于受到来自液体培养基的渗透胁迫和震荡引起的流体剪切作用，部分细胞迅速褐化，褐化的细胞活力下降、生长缓慢甚至死亡。褐化是细胞中的酚类物质被多酚氧化酶催化为醌类化合物，醌类再通过非酶促反应产生有色物质而导致细胞褐变，抑制细胞内其它酶的活性，影响其他细胞的正常代谢。严重的会导致摇瓶内所有细胞全部死亡。所以及时控制褐化反应的发生非常重要。

目前，在植物细胞悬浮培养体系的建立过程中，减轻褐化的主要措施有：（1）选择适宜的培养基和培养条件，如调整培养基中无机元素组成和浓度，改变培养温度、光照和pH；（2）缩短继代时间，减轻褐化毒害；（3）在培养基中添加吸附剂活性炭和聚乙吡咯烷酮（PVP）等。但这些处理往往不能有效地抑制褐化。缩短继代时间，连续转移外植体不仅费时费力而且大大增加了污染的几率。吸附剂混合在培养液中在震荡培养时不仅影响细胞的传质与传氧，而且会影响激素的活性，与不添加吸附剂的对照组相比，悬浮体系的相对褐化程度下降仅为16%，生物量（细胞湿重）的积累变化不大。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能够显著降低甘草细胞固-液转化后建立悬浮培养体系的过程中细胞褐化现象的方法。

本发明所采用的技术方案：一种抑制甘草细胞固-液转化后发生褐化的方法，包括以下步骤：

1）种子细胞的选择：选取固体培养基上经连续继代培养后颗粒性强、分散性高的甘草细胞作为种子细胞。

2）接种：将种子细胞以8-10%的接种率接种到第一液体培养基中，摇床振荡培养。接种后0-3d摇床转速控制在60-80rpm，3天后逐渐加大摇床转速到80-100rpm。

3）清洗：培养到6-9d，摇瓶中出现不适应悬浮培养破碎死亡细胞的碎片和部分细胞发生酶促褐化释放的醌类物质，需进行清洗。将振荡培养的摇瓶于超净工作台中静置1min左右，待颗粒性强、生长状态好的细胞沉淀后，打开瓶口，将培养基和悬浮物一并弃去，换新鲜的第二液体培养基。如经清洗完毕后细胞悬浮液仍呈较浑浊的状态，需用新鲜的第二液体培养基反复冲洗直到培养液目测较为清澈。

4）悬浮培养：将清洗完的摇瓶细胞置于摇床继续振荡培养，摇床转速为100-120rpm。

本发明提供的一种抑制甘草细胞固-液转化后褐化的方法还具有如下附加技术特征：

所述固体培养基为改良MS培养基，即基本MS培养基为基础含有以下浓度的物质：2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）0.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）0.5mg/L、萘乙酸（NAA）0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂8-10g/L。

所述第一液体培养基为不加琼脂的改良MS培养基中添加0.1mmol/L抗坏血酸或0.1mmol/L L-半胱氨酸。

所述第二液体培养基为不加琼脂的改良MS培养基。

所述固体培养基、第一液体培养基及第二液体培养基的pH均为5.8-6.0，培养温度为25-27℃。

采用本发明的有益效果是提供一种操作简单的有效抑制甘草细胞固-液转化后褐化的方法。抑制褐化效果良好，细胞生物量积累明显增加，当抗坏血酸作为褐化抑制剂时，在悬浮培养的第六天，与对照组（不加抑制剂，不分阶段控制摇床转速、没有清洗过程）相比，悬浮体系的相对褐化程度下降55.8%，生物量（湿重）的积累提高35.2%。L-半胱氨酸也是一种有效的褐化抑制剂，在悬浮培养的第六天，与对照组相比，相对褐化程度下降52.6%，生物量（湿重）的积累提高12.5%。获得的甘草悬浮细胞分散均匀，生长状态好，为进一步扩大培养提供良好的种子细胞或可作为优秀的科研材料。

附图说明：

图1为用该方法培养一个周期后甘草细胞（右）与未处理的甘草细胞（左）对比图。