[发明专利]高密度聚乙烯亚胺修饰介质提高蛋白质吸附容量和吸附速率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高密度聚乙烯亚胺修饰介质在提高蛋白质吸附容量和吸附速率中的应用，属于生物技术领域中的蛋白质色谱分离技术。

背景技术

聚乙烯亚胺（poly(ethylenimine)，PEI）是一种价格低廉、毒性低、带有支状结构的长链阳离子聚电解质。PEI聚合物分子中伯、仲、叔胺的理论比例为1:2:1，完全质子化时电荷密度可达23.3mEq/g，是目前电荷密度最高的物质。PEI在较宽的pH值范围内都带正电荷，可以可逆性吸附带负电荷的物质。PEI具有较好的生物相容性，已广泛地应用于基因转移和生物制品的分离纯化，例如提取肝素、移除细菌内毒素等。近年来，研究者发现PEI有利于保持酶的活性及增加稳定性，因此也将PEI偶联于多种基质上用于α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、乙醇脱氢酶等多种酶的固定化。另外，由于PEI的电荷密度极高，PEI修饰介质在促进同电荷溶菌酶氧化复性中也有较好的应用。这些发现均表明，PEI非常适用于活性蛋白质的分离纯化，为PEI应用于蛋白质色谱分离纯化中提供基础。

PEI分子量较大，含有大量高反应活性的伯氨基团，容易与色谱基质偶联而获得高PEI接枝密度的色谱介质。此外，PEI含有大量可用于离子交换的伯、仲、叔胺基团，因此可直接合成高离子交换容量的接枝型离子交换剂，而无需后续配基偶联反应。因此，PEI十分适用于色谱基质的接枝修饰。

然而，目前对PEI修饰介质在蛋白质吸附中的应用主要集中于通过PEI改性羟基磷灰石以改变蛋白质在色谱柱上的保留行为、修饰色谱基质通过固相萃取捕获蛋白质。此外，目前用于蛋白质捕获的PEI修饰介质，其蛋白质捕获量均较低，且PEI修饰量未知。尚未有研究涉及在色谱基质上接枝修饰PEI以改变蛋白质在离子交换剂上的吸附容量和吸附速率。

虽然，研究者们也已经开发了一系列的聚合物接枝修饰介质应用于提高蛋白质的吸附容量和传质速率。然而，这些接枝型介质多是通过先在基础介质上连接不带电的葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯等中性长链聚合物，再偶联较短的离子交换配基而得到的。这类介质修饰方法需要两步偶联反应，合成工艺较为复杂。同时，葡聚糖价格昂贵，介质合成成本较高，而聚甲基丙烯酸酯的单体毒性较大，合成危险性较大。此外，这些接枝型介质的操作范围较窄，通常只能在较低盐浓度的环境中使用。

本专利即为将高密度聚乙烯基亚胺修饰的色谱介质应用于蛋白质的快速高效吸附中，该介质同时具有高吸附容量和高传质速率，应用范围宽，合成工艺简单，成本低廉，生物相容性好，安全低毒。因此，高密度聚乙烯基亚胺修饰介质非常适用于蛋白质的快速高效吸附中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，进而提供一种高密度聚乙烯亚胺修饰介质提高蛋白质吸附性能。上述介质不但具有较高的吸附容量，同时具有较快的传质速率，而且也可在较宽的盐浓度范围内使用。

本发明的技术方案概述如下：

一种用高密度聚乙烯亚胺修饰介质提高蛋白质吸附容量和吸附速率的方法，该介质为平均粒径50-170μm的琼脂糖凝胶颗粒，表面通过环氧基间隔臂修饰高密度聚乙烯亚胺（PEI）的介质。

上述高密度PEI修饰色谱介质的结构表达如下：

上述PEI的分子量（MW）为1200–750000Da，结构式如下。

本发明的高密度聚乙烯亚胺修饰方法，其步骤如下：

1)介质的环氧化反应

将平均粒径为50-170μm的琼脂糖凝胶的介质，加入到二甲基亚砜中，制备介质悬浮液，二甲基亚砜体积用量为介质体积量的2倍。再向上述介质悬浮液中加入环氧氯丙烷，环氧氯丙烷体积与介质体积相等，混合均匀，制得混合悬浮液。最后向混合悬浮液中加入浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液体积为介质体积的2倍，置于20-35℃的恒温水浴，120-200rpm活化1-4h，之后用去离子水冲洗介质至无游离环氧氯丙烷，制得活化介质。

2)活化介质的PEI偶联