[发明专利]一种几丁质脱乙酰基酶及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体的说一种几丁质脱乙酰基酶及其构建方法和应用。

背景技术

几丁质（chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的多聚体，是天然多糖中十分重要的一类，其数量仅次于世界上资源最丰富的纤维素，但其利用价值比纤维素更高，是自然界中数量第二多的的含氮类有机化合物，被欧美学术界称为世界第六生命要素。很多类似于虾蟹等节肢动物的外壳里都存在几丁质；像昆虫、动物体表及消化道里也含有丰富的几丁质。

据估计，自然界中的几丁质的生物合成量超过1000亿吨，而人类每年所需几丁质的量也高达3.7×10⁴吨，主要是海洋动物产品加工的废弃物。另外，海洋中产生的大量废弃物中，几丁质将近一亿吨，而且海洋生物圈中产生的几丁质占全球几丁质总量的绝大部分，可以说是一种取之不尽的生物宝库。

而壳聚糖（脱乙酰甲壳素，chitosan）是几丁质的一类最重要的衍生物，也是自然存在的唯一一种碱性低聚多糖，可以应用于食品、化妆品、纺织、医疗、印染、保健、废水处理等许多领域，其利用价值很高，是市场推广和产品研发的有力组成部分。

目前工业上生产壳聚糖普便采用强碱热化学法，该方法生产壳聚糖存在较多的缺陷和不足，主要包括以下几方面：生产过程耗能大、消耗大量强碱，严重污染环境，不能获得质量均一、具有特定脱乙酰度的壳聚糖等。几丁质脱乙酰酶能够催化几丁质生成壳聚糖，具有工艺条件温和、环境友好、产品质量高等优点。采用几丁质脱乙酰酶生产壳聚糖则可以解决强碱热化学法制备壳寡糖的诸多缺陷和不足，生产出质量均一、性能稳定的壳聚糖，满足生物医学等领域对壳聚糖的高质量要求。

发明内容

本发明目的在于为解决目前酶法制备壳聚糖工艺中的几丁质脱乙酰酶不足的问题，提供一种几丁质脱乙酰基酶及其构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种几丁质脱乙酰基酶，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus ATCC10987）几丁质脱乙酰基酶（chitin deacetylase，CDA）核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，或者

在SEQ ID NO.2中限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或者几个氨基酸且仍具有几丁质脱乙酰基酶活性的由SEQ ID NO.2衍生出来的蛋白质。

所述几丁质脱乙酰基酶编码的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

几丁质脱乙酰基酶的构建方法：

1）构建几丁质脱乙酰基酶重组表达载体质粒pCT7-CHISP6H-BcCDA；

2）将步骤1)所得重组表达载体质粒导入大肠杆菌宿主细胞（BL21(DE3)），进行诱导表达，获得表达产物；

3）以金属螯合层析柱分离纯化步骤2)所得到的重组蛋白，即SEQ ID NO.2中氨基酸所示的重组几丁质脱乙酰基酶；或者

在SEQ ID NO.2中限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或者几个氨基酸且仍具有几丁质脱乙酰基酶活性的由SEQ ID NO.2衍生出来的蛋白质。

所述步骤3）中以金属螯合层析柱一步法纯化获得电泳纯的SEQ ID NO.2中氨基酸所示的重组几丁质脱乙酰基酶。

几丁质脱乙酰基酶的应用，其特征在于：所述重组几丁质脱乙酰基酶可用于制备壳聚糖。

本发明所具有的优点：本发明获得了一种几丁质脱乙酰基酶BcCDA基因序列，并在大肠杆菌中实现其高效分泌表达以及一步法纯化重组几丁质脱乙酰基酶BcCDA。所得重组BcCDA的脱乙酰基活性，为酶法制备壳聚糖工艺的开发与应用提供了基础。具体的说本发明重组几丁质脱乙酰基酶BcCDA的获得对几丁质资源的深度开发与高值化利用具有重要的理论意义和实践意义。

附图说明

图1为本发明实施例提供的BcCDA基因推导的氨基酸序列特征。

图2为本发明实施例提供的诱导表达的重组几丁质脱乙酰基酶酶解实验结果，其中，A为未涂布几丁质脱乙酰基酶室温放置7天后的4-硝基乙酰苯胺固体平板；B为涂布几丁质脱乙酰基酶室温放置3天后的4-硝基乙酰苯胺固体平板；C为涂布几丁质脱乙酰基酶室温放置7天后的4-硝基乙酰苯胺固体平板。

图3为本发明实施例提供的重组蛋白rBcCDA经亲和层析纯化色谱图。图中方框处标注的吸收峰即为通过分段洗脱得到的rBcCDA。

图4为发明实施例提供的亲和层析纯化后的重组蛋白脱盐结果。