[发明专利]基于微间距阵列电极的免疫定量传感器、制作方法及检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法

权利要求书

1.基于微间距阵列电极的免疫定量传感器，其特征在于：包括由叉指式双电极组成的微间距阵列电极，所述微间距阵列电极包括一对梳形微电极，每个梳形微电极均有多个叉指（3），所述一对梳形微电极上的多个叉指（3）交叉排列，形成叉指形状；所述微间距阵列电极的正电极（1）和负电极（2）的梳形齿宽均为1-100μm，电极间隙为1-100μm，且微间距阵列电极的表面固定有200μL的大肠杆菌O157：H7单克隆抗体，该大肠杆菌O157：H7单克隆抗体浓度为8μg/mL；其中，碱性磷酸酯酶标记的大肠杆菌O157：H7单克隆抗体在检测时加到微间隙阵列电极上，同被检测样品中的大肠杆菌O157：H7及碱性磷酸酶标记的大肠杆菌O157：H7多克隆抗体发生免疫夹心反应。

2.根据权利要求1所述的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器，其特征在于：所述组成微间距阵列电极的叉指式双电极为16-96孔。

3.根据权利要求1所述的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器，其特征在于：所述每个叉指（3）的长度为1-3mm，宽度为1-100μm。

4.一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器的制作方法，其特征在于：该方法包括微间距阵列电极的制作步骤，以及在微间距阵列电极的表面固定有200μL的大肠杆菌O157：H7单克隆抗体的步骤；所述微间距阵列电极的制作步骤具体包括：

S1、采用光刻法在陶瓷片上形成具有正电极（1）和负电极（2）的一对梳形微电极，且每个梳形微电极均有多个叉指（3），所述一对梳形微电极上的多个叉指（3）交叉排列，形成微间距叉指阵列电极；

S2、对所述微间距叉指阵列电极硅烷化处理；

所述在微间距阵列电极的表面固定有200μL的大肠杆菌O157：H7单克隆抗体的步骤具体包括：

S3、将上述步骤S2中经硅烷化处理过的微间距叉指阵列电极浸入5％的戊二醛溶液中，在室温条件下活化1小时；

S4、将上述微间距叉指阵列电极用水淋洗干净，并用超纯水清洗三次后，在电极上滴加200μL大肠杆菌O157：H7单克隆抗体；

S5、用PBS将上述步骤S3中制作的微间距叉指阵列电极清洗三次，将清洗后的电极的每孔加入浓度为1%的300μLBSA溶液中，在温度为37℃的环境下培育1小时，制成免疫定量传感器，最后将免疫定量传感器保存于4℃备用。

5.根据权利要求4所述的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器的制作方法，其特征在于：所述步骤S2的具体包括以下步骤：

S21、将微间距叉指阵列电极在无水乙醇及丙酮中浸泡15min；

S22、将微间距叉指阵列电极在piranha溶液中浸洗10min，1M的NaOH溶液中浸泡30min，并用水冲洗干净，晾干；

S23、将经步骤S22处理后的微间距叉指电极浸入含2.5%APTES、1%H2O的无水乙醇中，在温度为4℃的条件下硅烷化24小时；

S24、硅烷化后的微间距叉指阵列电极用乙醇清洗干净，在氮气流下吹干并在温度为4℃的条件下老化1小时。

6.一种采用基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法，其特征在于：该方法具体包括以下步骤：

S10、分别取一系列不同浓度的大肠杆菌O157：H7样品溶液，将所述每一种浓度的大肠杆菌O157：H7菌悬液和作为阴性对照的沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和阪崎杆菌菌悬液、PBST分别加入到包埋有大肠杆菌O157：H7单克隆抗体的免疫定量传感器上，并在37℃恒温箱中反应60min；

S20、用PBS缓冲液洗脱三次后加入出血性大肠杆菌O157：H7多克隆抗体作为一抗，并在37℃恒温箱中反应60min后再用PBS洗脱三次，加入AP标记山羊抗兔IgG（H+L）作为二抗，并在37℃恒温箱中反应60min后再用PBS缓冲液洗脱三次；

S30、在免疫定量传感器的每孔中加入100μL AgNO3，并在37℃恒温箱中避光反应15min后再用PBS缓冲液洗脱三次；

S40、将上述步骤的S30的免疫定量传感器的工作电极的正电极（1）与电化学工作站的工作电极连接，电化学工作站对电极与参比电极复合，再与免疫定量传感器工作电极的负电极（2）连接，并采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录免疫定量传感器电流随电位变化的响应曲线，得出电导值。

7.根据权利要求6所述的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法，其特征在于：

在所述步骤S10中，所述大肠杆菌O157：H7样品溶液的浓度为0.1μg/mL、10.0μg/mL或10000.0μg/mL，所述沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和阪崎杆菌菌悬液、PBST各为100μL。