[发明专利]一种食品级中性蛋白酶的提纯方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种食品级中性蛋白酶的提纯方法。

背景技术

目前，工业上采用枯草芽孢杆菌AS1.398生产中性蛋白酶已有多年的历史,是一类被广泛应用于工业生产的酶类,在洗涤剂、制革、丝绸、食品加工等多种行业上有着广泛的用途。目前我国发酵生产中性蛋白酶工艺主要是发酵液直接喷雾干燥或盐析沉淀后再烘干，此类产品由于生产工艺过程的局限性，酶活在高温环境损失较大，酶活收率低，产品杂质多，微生物等卫生指标不符合食品行业要求，应用范围受限制，因此对发酵液中性蛋白酶的分离、提纯很有必要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食品级中性蛋白酶的提纯方法，能有效的解决中性蛋白酶活损失问题，酶活收率明显提高，提取总收率达到70%以上；所得到的食品级中性蛋白酶的纯度和酶活都比工业用酶高，卫生指标符合食品级要求，可应用于食品加工行业，产品附加值得到提升。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种食品级中性蛋白酶的提纯方法,其特征在于包括如下步骤：

1）采用枯草芽孢杆菌AS1.398菌种进行发酵，得到中性蛋白酶发酵液；然后往发酵液中添加絮凝剂，搅拌均匀，静置30分钟，使杂质与絮凝剂结合成团状；有利于过滤;

2）板框过滤：将絮凝反应完成后的中性蛋白酶发酵液进行板框过滤，过滤压力控制在0.6-0.8MPa，收集滤液;

3）离心：将板框过滤收集的滤液进行高速离心，转速为：10000rpm,进料流速为80L/h，收集离心液;

4）粗滤：将收集的离心液进行粗滤，采用聚偏氟乙烯滤膜进行过滤，聚偏氟乙烯滤膜的孔径为0.22um和0.1um（天津爱生膜过滤技术有限公司生产，型号分别MFOc和MFIb1），操作压力0.1MPa；

5）精滤：将经过粗滤后的料液采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩，

聚砜超滤膜的截留分子量为10K（天津爱生膜过滤技术有限公司生产，滤膜型号USIb1），操作压力0.1MPa；得到中性蛋白酶浓缩液；目的是过滤除去大部分水和小分子盐类等物质，截留中性蛋白酶分子，起到提纯作用;

6）添加酶活保护剂：往步骤5）得到的中性蛋白酶浓缩液中添加酶活保护剂，搅拌均匀；其中，所述酶活保护剂包括海藻糖和β-环状糊精，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.4-1.2%，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.2-0.6%;

7）沉淀:往经过步骤6）处理后的中性蛋白酶浓缩液中添加食用乙醇，边添加边缓慢搅拌，使得中性蛋白酶分子结晶沉淀出来，收集絮状的中性蛋白酶沉淀部分;

8）真空干燥：将步骤7）收集得到的絮状的中性蛋白酶沉淀部分进行真空干燥，即可得到食品级中性蛋白酶。

实现本发明的目的还可以通过采取如下技术方案达到：

实现本发明的一种实施方式是：在步骤1）中，所述絮凝剂是阴离子聚丙烯酰胺；添加絮凝剂时，需先将絮凝剂按重量比为1:1000的比例溶解于水中，得到预溶絮凝液，然后将预溶絮凝液按重量比为1:100的比例添加到中性蛋白酶发酵液中，缓慢搅拌10分钟。

实现本发明的一种实施方式是：在步骤4）中，要求料液经过两次过滤，滤膜孔径分别为0.22um和0.1um。以达到最佳的除杂效果。

实现本发明的一种实施方式是：在步骤6）中，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.8-1.2%，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.5%。

实现本发明的一种实施方式是：在步骤6）中，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.8%，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.5%。

实现本发明的一种实施方式是：在步骤7）中，所述食用乙醇的浓度为90%；添加定量的浓度为90%的食用乙醇，使得最终的中性蛋白酶浓缩液中含食用乙醇的重量百分含量为50%。

本发明的有益效果在于：