[发明专利]高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生及用其生产甘草次生代谢产物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用发根农杆菌侵染乌拉尔甘草幼苗茎节诱导产生毛状根的方法，并用此毛状根生产药用次生代谢产物，例如甘草苷和甘草酸等，尤其是高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法及用毛状根生产甘草次生代谢产物的方法。 

背景技术

乌拉尔甘草（Glycyrrihiza uralensisi Fisch.）是我国重要的传统中药，具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃等功效，被誉为“百草之王”，其药用价值是其它资源不能替代的。甘草的主要药效成分包括甘草酸和甘草苷，其中甘草酸是非常珍贵的解毒剂，可防治病毒性肝炎、高血脂和癌症等疾病；甘草黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗衰老和保肝等药理作用，此外，甘草不仅是重要的药材，还广泛应用于日用化工品及食品领域，其中甘草酸还是一种天然甜味剂，甘草苷是一类天然抗菌剂和防腐剂。随着甘草资源的不断开发与利用，国内市场甘草的需求总量为9.0万～10.0万吨，但全国甘草总量只有2.5万～3.0万吨，资源短缺已趋白热化，严重影响了医药企业的生产。2001年9月，我国为了保护日益匮乏的甘草资源，限制了对野生甘草的采挖，使甘草资源缺乏加剧，目前人工栽培仍是甘草生产的主要途径，然而，人工栽培周期长，并且受地域限制，特别是在有效成分含量上，人工种植甘草与野生甘草还存在很大的差距，还不能满足市场需求。人工栽培的甘草中的甘草酸含量基本在2%以下，较野 生甘草的平均值低30～40%，达不到我国药典2%的最低要求，甘草资源匮乏及其质量下降成为限制甘草资源深度开发利用的瓶颈。 

随着生物工程技术的不断提高，利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）诱导药用植物产生毛状根，并对毛状根进行离体培养，迅速大量提取有效成分，是药用植物资源可持续发展的有效途径之一。 

毛状根培养技术是20世纪80年代后期在植物细胞领域发展起来的一项新技术，与一般的植物细胞培养相比，毛状根可以生长在不含激素的培养基上。这一培养系统对传统药材来说很重要，因为约1/3的传统中药材是植物的根部，曾经被认为难以通过细胞培养来生产的许多源于植物根部的药物，现在正被设法通过培养毛状根来生产，发根农杆菌Ri质粒转化的毛状根生长快，易于培养，活性成分含量高，具有表达完整的代谢通路，为药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景；目前，关于乌拉尔甘草毛状根培养的研究并不多，大部分报道的毛状根诱导方法都是采用离体子叶节、子叶、下胚轴进行毛状根诱导。但目前所公开的乌拉尔甘草毛状根诱导培养都采用离体组织进行遗传转化，因此诱导率相对较低，并且获得的毛状根大量携带农杆菌，除菌比较困难，不利于继续进行毛状根悬浮培养，实际应用价值不大，无法满足生产需求。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，能够高效、稳定诱导乌拉尔甘草毛状根的产生； 

本发明的目的之二是提供一种用上述乌拉尔甘草毛状根生产甘草次生代谢产物的方法，能够得到生产甘草苷、甘草酸的原料，生产出甘草苷、甘草酸。 

一种高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特别之处在于，包括 如下步骤： 

（1）无菌外植体的获得： 

取乌拉尔甘草种子，灭菌后接种于幼苗培养基进行培养，获得株龄12～15d的无菌幼苗，切除根部后作为外植体； 

（2）发根农杆菌工程菌液的制备： 

取含有Ri质粒的发根农杆菌，经活化培养，挑取单菌斑接种于YMB液体培养基培养至菌液OD₆₀₀值为0.6～0.8，离心后弃上清液，加入等体积Ms液体培养基稀释至菌液OD₆₀₀值为0.6～0.8，添加乙酰丁香酮至终浓度为100～150μM，制成工程菌液待用； 

（3）针刺幼苗茎节诱导毛状根产生： 

按照步骤（1）中获得的外植体，经步骤（2）中获得的工程菌液进行农杆菌介导转化，再将介导转化过的外植体接种于共培养基中，培养24h～48h，然后将外植体接入抑菌培养基中，除菌培养10～15d，直至在外植体上子叶茎节处长出毛状根。 

步骤（3）中针刺幼苗茎节诱导毛状根产生的具体步骤为：用注射器针头蘸取制备好的发根农杆菌工程菌液，在处理好的外植体即无菌甘草幼苗的子叶节处穿刺1-2次，将穿刺过的外植体置无菌滤纸上吸去多余的菌液，然后移栽到不含激素和抗生素的Ms培养基中，置25±1℃下共培养2～3天，然后转移到含头孢霉素300～500mg/L的Ms培养基中，培养10-15天即可在子叶节处出现白色凸起，3～5天后在凸起处长出簇状绒毛根系。