[发明专利]一种石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法

权利要求书

1.一种石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，其特征在于步骤如下： 

1)采集石油污染0～20cm表层土壤进行-20℃保存，按照ZR Soil Microbe DNA MiniPrep^TM土壤DNA提取试剂盒步骤进行DNA提取。 

2)引物设计遵循引物设计原则，从土壤中能降解石油烃的菌株序列中比对设计同源性较高的萘降解基因扩增引物Nahf/Nahr，见下表。 

3)将提取净化后的DNA经过PCR仪(Techne TC5000)进行Nah降解基因特异性扩增，产物经过2.0％琼脂糖凝胶电泳检测是否是目的片段。 

4)按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒的操作步骤进行切胶回收目的基因，按照pEASY-T1Clonning Kit步骤将目的基因导入Trans-T1感受态细胞，培养后涂有20mg/ml X-gal和100mg/ml氨苄青霉素平板上进行蓝白斑阳性克隆子的筛选。 

5)挑选白色菌落培养后的载体细胞经过Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒进行质粒的提取，对获得的质粒经过Nah降解基因特异性PCR后上2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用微量核酸蛋白质分析仪测定所提质粒的拷贝数。 

6)将所提质粒中含有目的基因Nah的DNA模板依次稀释10倍梯度进行荧光定量PCR(BioRad CFX96)完成外标曲线的建立，同时将不同的石油污染样品DNA进行荧光定量PCR，温度程序为：95℃保持5min；经过以下40个周期：变性温度为94℃，保持5s，退火温度57℃，保持60s，后经过72℃的延伸30s。熔解曲线温度：Nah基因从57℃保持5s，然后逐渐升到95℃(增量为0.5℃) 

7)根据建得的外标曲线测定供试土样中萘降解基因Nah拷贝数，空白为不加DNA的阴性对照，做三个平行。 

8)检测限为建立外标曲线时，荧光信号和稀释目标DNA浓度不成线性比例时，所得到对应目的基因拷贝数。 

荧光定量PCR体系如下： 

2.根据权利要求1所述的石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，其特征在于：Nah降解基因PCR退火温度范围为55～57℃。 

3.根据权利要求1所述的石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，其特征在于：Nah降解基因PCR的最适变性温度为94℃。 

4.根据权利要求1所述的石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，其特征在于：定量PCR温度设计为：95℃保持5min；经过以下40个周期：Nah降解基因变性温度为94℃，保持5s，退火温度为57℃，保持60s，后经过72℃的延伸30s。熔解曲线温度：57℃保持5s，然后升到95℃(增量为0.5℃)。