[发明专利]运用免疫特异性显微分离不同血型混合上皮细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种不同血型个体混合上皮细胞的分离方法，尤其涉及一种运用免疫特异性显微切割分离不同血型混合上皮细胞的方法。

背景技术

在性犯罪案中,乳头擦拭物、咬痕、男性外生殖器擦拭物一类检材中常混有男性口腔上皮细胞、女性皮肤表皮细胞或男性皮肤表皮细胞、女性阴道上皮细胞，如不进行分离，DNA分型检验得到的多为混合型。混合细胞检材是较常见的法庭科学生物物证，包括精子-精子混合检材、上皮细胞-上皮细胞混合检材等，不同个体细胞的混合存在，给混合细胞检材检验鉴定、案件诉讼带来了极大困难。

理论上，解决上述混合斑检材DNA分型有三种方法：一是分离混合斑中来自不同个体的细胞；二是应用Y染色体特异的DNA基因座引物，用PCR扩增其特异性片段，得到男性Y-STR分型；三是将混合斑中所有的遗传标记都检测出来，然后与案件相关的个体进行可能性比率、峰面积框架分析。

第一种方法中，利用激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）技术从混合精斑（精子细胞-上皮细胞混合）中分离精子细胞的方法已经得到了发展，LCM技术将光学显微技术与激光细胞切割技术相结合，能够在显微镜的直视下迅速准确地选取单一细胞，将单一细胞从混合细胞中分离出来，快速得到单一的DNA分型数据；但由于LCM技术基于光学显微镜下精子与上皮细胞的形态差异进行分离，不同个体精子无法从形态上进行区分，致使不同男性个体精子混合存在时（轮奸案）单一男性DNA分型无法得以实现。同理，由于不同个体上皮细胞形态上无法区分，致使激光捕获显微切割技术无法应用于不同个体混合上皮细胞的检验。

第二种方法中，Y-STR具有男性特有、灵敏度高的特点，但研究表明一些Y染色体STR基因座可在女性样品中检测到，Y-STR各基因座的遗传是连锁的，同一父系的男性，具有同样的单倍型，个体识别能力较低；在轮奸案中不同个体精子细胞的混合存在，致使Y-STR检验得到的DNA分型为混合分型，无法得到单一男性Y-STR分型。

第三种方法中，可能性比率、峰面积框架与混合斑中两个个体细胞数比例相关，当混合斑中一个个体细胞数比另一个体细胞数大于10倍时，由于PCR过程中无法避免的优势扩增，会导致细胞数较多个体的DNA分型覆盖细胞数较少个体的分型，致使细胞数较少个体逃避了法律制裁。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种将免疫标记、显微激光切割技术相结合的用于分离混合上皮细胞的方法，可以在显微镜下切割分离A和O，或者B和O，或者A和B血型个体的混合上皮细胞。

本发明的技术方案如下：一种运用免疫特异性显微分离不同血型混合上皮细胞的方法，包括以下步骤：

1）将含有混合上皮细胞的擦拭棉签放入含有5～10ml PBS的离心管中，浸泡15～30min，使棉签上的混合上皮细胞完全脱落，充分震荡混匀使细胞在溶液中均匀悬浮分散，获得混合上皮细胞悬液；

2）取上述制备的混合上皮细胞悬液0.2～0.5mL涂于显微激光粘附载玻片上，烤干；

3）将载玻片置于0.5%～1%Triton-100溶液内透明15～30分钟，PBS洗涤；

4）将载玻片放入1%柠檬酸盐溶液中煮沸10～15min，取出冷至室温后用PBS洗涤；

5）滴加0.5ml山羊血清于载玻片细胞斑迹处，封闭15min，滴加0.3～0.5mL用PBS缓冲液稀释的抗人血型A抗原抗体或抗人血型B抗原抗体，37℃孵育1～1.5小时，PBS洗涤，其中A和O血型个体的混合上皮细胞中加入抗A抗体，B和O血型个体的混合上皮细胞中加入抗B抗体，A和B血型个体的混合上皮细胞中加入抗A抗体或者抗B抗体；

6）用PBS缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG，滴加0.3～0.5mL于载玻片上，电热恒温箱内37℃孵育1～1.5小时，PBS洗涤；

7）滴加0.3～0.5mL DAB染色液于载玻片上，染色1～5min，去离子水洗涤；

8）将载玻片放入苏木精染液中3～5分钟，然后放入浓度为90%和100%的酒精各1分钟，晾干载玻片，在显微镜下观察，用显微激光切割捕获仪将细胞膜染为棕色和细胞膜未染色的细胞分别切割回收于回收管中。

步骤1中所述擦拭棉签为来源于性侵犯案乳头擦拭物或者咬痕或者男性外生殖器擦拭物。

步骤5中所述用PBS缓冲液稀释的抗人血型A抗原抗体或抗人血型B抗原抗体，稀释比例为1:200～500。