[发明专利]细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及畜禽养殖业的检测方法，具体涉及一种耐药基因NDM-1的PCR检测引物及应用。 

背景技术

2010年8月11日，英国医学界宣称南亚出现了一种新型细菌，几乎对所有抗生素都有抗药性，被称为“超级细菌”。因首先在印度首都新德里出现又称为新德里金属-β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1）。NDM-1不是一种细菌，而是编码金属-β-内酰胺酶(metallo-β-lacta-mase，MBL)的一种基因。随后，在英国、美国、比利时、法国、日本、澳大利亚等全球大多数国家发生了携带NDM-1基因的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸杆菌等细菌感染人并导致死亡病例，临床表现超级耐药现象。 

携带NDM-1基因的细菌会产生一种特殊的β-内酰胺酶，且活性部位为金属离子，属于超广谱β-内酰胺酶的一种，这种酶可分解β-内酰胺环结构，可使任何含β-内酰胺环结构的抗生素失活，因此，携带这种酶的细菌可以抵抗所有含β-内酰胺环结构的抗生素，从而导致临床用药困难。 

虽然各国学者对NDM-1基因的研究不断有文献报道，但主要集中在对人体的检测，并也只有从人体中检测出携带基因NDM-1的细菌，而在畜牧兽医方面的研究相对较少。NDM-1基因存在于DNA的结构中，被称为质粒。质粒可以在细菌中自由复制和移动，从而使各种菌种均有可能携带该NDM-1基因，具有传播和变异的惊人潜能。尽管我国畜牧业尚未出现携带NDM-1基因的耐药细菌，但携带NDM-1耐药细菌的出现也为我国畜牧业滥用抗生素敲响了警钟。那么，这种导致人类发病的“超级耐药细菌”在畜禽养殖场中到底是否存在？这需要建立相应的检测方法进行检测。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明建立 “超级耐药细菌”NDM-1基因的PCR快速检测方法，调查畜禽养殖场中分离到的耐药细菌是否携带NDM-1基因。 

本发明的目的在于提供一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物。 

本发明的目的在于提供一种包含上述检测引物的细菌耐药基因NDM-1的PCR检测试剂盒。 

本发明所采用的技术方案如下： 

一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物，其核苷酸序列分别如下所示：

NDM-1F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTCC（SEQ ID NO:1）；

NDM-1R: TTGTCCTGATGCGCGTGAGTC（SEQ ID NO:2）。

一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测试剂盒，该试剂盒包含上述的检测引物。 

本发明的有益效果是： 

1）快速高效：整个检测只需PCR扩增和电泳检测即可完成；

2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需进行常规的PCR即可；

3）高特异性：本发明对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌的 DNA均不发生扩增；

本发明设计的特异性引物不与其他核酸序列发生错配，特异性高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；

4）高灵敏度：本发明的最低检测极限可达到9.18×10^-7μg/μL。

附图说明

图1为PCR扩增检测细菌耐药基因NDM-1的特异性实验图； 

图2为PCR扩增检测细菌耐药基因NDM-1的灵敏度实验图，从左到右的电泳泳道依次为9.18×10^-2μg/μL、9.18×10^-3μg/μL、9.18×10^-4μg/μL、9.18×10^-5μg/μL、9.18×10^-6μg/μL、9.18×10^-7μg/μL、9.18×10^-8μg/μL、9.18×10^-9μg/μL的阳性标准品的扩增结果； 

图3为PCR扩增检测细菌耐药基因NDM-1的重复性实验。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

实施例1：