[发明专利]一种胆盐水解酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种胆盐水解酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

通过底物特异性的研究发现，胆盐水解酶有很强的底物选择性，其水解甘氨结合胆盐（glyco-conjugated bile salts）的能力远远高于水解牛磺结合胆盐（tauro-conjugated bile salts）的能力，这与报道的大多数BSH的底物特异性一致。然而正常人体中甘氨结合胆盐与牛磺结合胆盐的比例为3:1，这将导致牛磺结合胆盐不能被BSH很好的水解。

胆盐水解酶的底物是由类固醇核部分和氨基酸基团（甘氨酸/牛磺酸）两部分组成的。Huijghebaert和Hofmann发现，修饰底物的酰胺键或减少底物氨基酸部分末端基团的负电荷会显著降低胆盐水解酶对相应底物的水解能力。Batta等也发现胆酰甘氨酸水解酶（CGH）能有效水解由带有一到两个亚甲基的甘氨酸或牛磺酸类似物制成的底物。而且目前大多数文献中的动力学数据都表明BSH优先识别底物的氨基酸基团。然而Moser and Savage等发现BSH优先识别底物的类固醇核部分。此外，Batta等和Rossocha等的研究证实，类固醇部分的羟基取代基或异构化的羟基取代基对BSH的底物特异性没有影响，而且BSH是通过疏水相互作用而不是氢键与底物的类固醇部分结合的。因此，关于BSH对底物的识别位点还存在一定的争议，胆盐水解酶可能对类固醇核部分和氨基酸基团都有识别作用。也有可能是BSH对底物没有特异性的结合条件，只要氨基酸部分和类固醇部分合适且与底物结合口袋互补就行。为了增强BSH水解牛磺结合胆盐的能力以及揭示BSH与底物的结合机制，有必要寻找和研究决定其底物特异性的氨基酸残基（specificity-determining residue,SDR）。

本发明根据现有的报道，通过氨基酸序列比对分析以及同源建模等发现，L.plantarum BBE7 BSH 65位氨基酸的极性对BSH的底物特异性有一定的影响。并利用定点突变研究了突变体对酶的底物特异性的影响。

发明内容

本发明提供了一种胆盐水解酶突变体及其应用，主要涉及改变胆盐水解酶氨基酸序列的底物特异性。

所述突变体是胆盐水解酶，来源于植物乳杆菌L.plantarum BBE7，突变位点为第65位酪氨酸，突变后65位氨基酸是非极性氨基酸，具体为丙氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸中的任一一种。

另外，本发明还提供了一种获得胆盐水解酶突变的方法，是利用定点突变技术将胆盐水解酶底物特异性氨基酸突变为非极性氨基酸。具体为将植物乳杆菌L.plantarum BBE7胆盐水解酶第65位酪氨酸突变为非极性氨基酸：丙氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸中任一一种。

通过本方法除可将L.plantarum BBE7BSH65位氨基酸分别突变成了3个非极性氨基酸外，还可突变为2个极性氨基酸。方法的具体操作步骤如下：

1、利用在线工具ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)对底物特异性已知的BSH的氨基酸序列进行比对和分析。

2、采用在线软件Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org/)对L.plantarum BBE7的BSH进行3-D结构的同源模拟。并利用软件Accelrys Discovery Studio Client 2.5对该结构与C.perfringens 13 CBAH的结构（PDB code:2BJF,2BJG）进行叠加和分析。

突变菌株的构建，包括如下步骤：

1）以质粒pET-20b(+)-dmsA-bsh为模板，分别以下几对引物进行PCR扩增；

65A-F：5’-CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACGCCGATG-3’

65A-R：5’-CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCGGCGTAAAG-3’

65C-F：5’-CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACTGTGATG-3’

65C-R：5’-CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCACAGTAAAG-3’

65F-F：5’-CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACTTCGATG-3’