[发明专利]一种发酵生产重组牛虻抗血栓酶的方法

权利要求书

1.一种发酵生产牛虻抗血栓酶的方法，包括：(1)构建含牛虻抗血栓酶目的基因的高效表达工程菌株，(2)一级种子的培养，(3)二级种子的培养，(4)上罐发酵，(5)离心发酵液收集菌泥，进行纯化，其特征在于，在上罐发酵过程中，参数设置为pH值为6.5-7.5，溶氧值为不小于20％，生长温度为30℃-37℃，诱导期温度为25℃-37℃。

2.如权利要求1所述的发酵生产牛虻抗血栓酶的方法，其中，将kfpase基因正确置于大肠杆菌表达载体pet30a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选建立分泌表达kfpase的工程菌株。

3.如权利要求1所述的发酵生产牛虻抗血栓酶的方法，其中，一级种子的制备，挑取平板种子接种到三角瓶培养基，培养基为LB，37℃，200rpm，培养7-9h，OD600为1-2。

4.如权利要求1所述的发酵生产牛虻抗血栓酶的方法，其中，二级种子的制备，以1％接种量接种三角瓶培养基，培养基为LB，37℃，200rpm，培养14-18h，OD600为3-5。

5.如权利要求1所述的发酵生产重组牛虻抗血栓酶的方法，其中，上罐发酵过程中：

(1)4.5发酵培养基组成

称取glucose22.5g，yeast extract49.5g，tryptone85.5g，MgSO₄4.5g，KH₂PO₄13.5g，K₂HPO₄·3H₂O81g，(NH₄)₂SO₄18g，溶于4L水中，定容4.5L；

(2)待发酵罐灭菌，降温至37℃，调整参数，PH值为7.0，按2％的接种量接种；

(3)生长阶段，在基础料中生长3-5h，待培养基中的初始糖耗尽后，补50％葡萄糖溶液4-6h；

(4)诱导期，停止补葡萄糖，待葡萄糖耗尽，溶氧上升，PH回升后，添加终浓度为0.1mM-0.8mM的IPTG。通过50％葡萄糖溶液的间歇流加来控制pH值稳定在7.0左右；

(5)发酵过程中，工艺参数的控制为：pH值为6.5-7.5，溶氧值为不小于20％，生长期温度和诱导期温度为37℃。

6.如权利要求1所述的发酵生产重组牛虻抗血栓酶的方法，其中，将发酵液离心，收集菌泥，进行纯化。