[发明专利]一种抗人糖化白蛋白单克隆抗体及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗人糖化白蛋白单克隆抗体、单克隆抗体可变区基因及其用途。

背景技术

糖尿病作为一种慢性疾病，世界卫生组织2011年九月的报告指出全世界有3.46亿人患有糖尿病，而死于高血糖引起的后果人数在2004年估计就有340万。最新流行病学调查显示我国目前全国有糖尿病患者9240多万人。全国糖尿病患病率9.7%，我国已经成为全球糖尿病患病率增长最快的国家之一，到2020印度成为世界上糖尿病人数最多的国家。糖尿病作为一种慢性疾病，血液血糖过高，可以引起许多并发症。血糖监测是糖尿病日常诊治工作中非常重要的一个环节，血糖的有效检测可以有效的血糖控制从而延缓糖尿病急、慢性并发症的发生和发展。血糖的有效检测对控制血糖的浓度有着重要意义。糖化血清白蛋白（glycated albumin,GA）是血液中的葡萄糖与白蛋白分子发生非酶促糖化反应的产物，其约占血浆中糖化蛋白总量的80%，GA蛋白的量和血糖水平有正相关。因白蛋白在体内比较稳定，其半衰期短，约17-19天，故糖化血清白蛋白测定可有效反映体内过去2～3周内平均血糖水平。对于评价糖尿病患者近期血糖控制情况及反映短期内血糖水平的变化具有较高的临床价值。目前GA蛋白的测定方法主要有（1）高压液相离子交换法（HPLC法）。HPLC法测定GA可准确检测患者短期内血糖控制的总体水平，但由于其代价高昂，处理样本量小，不适宜临床常规开展而未得到广泛应用。（2）亲和色谱法和（3）比色法以及（4）免疫化学法由于存在精确性差，检测时间长等缺点，也没有能够推广。（5）近年由日本开发研制的应用液态试剂的酶法检测GA（GA-L），是在固体酶法（2002年由美国研制的一种特异性较高的糖化血清白蛋白测定方法）测定糖化血清蛋白的基础上开发出液态试剂。其减少了溶解处理，提高了操作性。同时加用糖化氨基酸以去除内源性糖化氨基酸对检测结果的影响，并利用对氧化性白蛋白特异性更高的溴甲酚紫替代原来的溴甲酚绿，减少了球蛋白对测定结果的影响，因此结果的精确性有一定提高。GA-L检测具有相对良好的稀释线性、日内重复性和日间稳定性，并与HPLC检测法有一定的一致性（r=0.879）。（6）免疫浊度法，可以快速准确特异测定血浆中糖化白蛋白的量。人糖化白蛋白和抗人糖化白蛋白抗体结合而出现凝集。从而阻碍光线透过，使透射光减少，其减少程度与人糖化白蛋白量成正相关。免疫浊度的的特异性、灵敏度及准确性取决于高度特异性和高亲和力的抗人糖化白蛋白单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种高度特异性的抗人糖化白蛋白单克隆抗体及其在糖化白蛋白检测中的应用。本发明所提供的抗人糖化白蛋白单克隆抗体是利用单克隆抗体杂交瘤技术获得。将人糖化白蛋白免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备单细胞悬液，将其与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合获得。该抗体敏度高、稳定性好，可大量制备，以及广泛用于检测人糖化白蛋白各种检测试剂盒。

本发明技术方案具体如下：

一种抗人糖化白蛋白单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

上述的抗人糖化白蛋白单克隆抗体为IgG1亚型。

本发明还提供了编码权利要求1所述的抗人糖化白蛋白单克隆抗体的基因，其特征在于编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了上述的抗人糖化白蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）将完全福氏佐剂与人糖化白蛋白溶液制成乳剂免疫Balb/c小鼠，分离脾脏细胞，将分离的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞以50%PEG介导融合，用酶联免疫法筛选阳性克隆，选取阳性最强的杂交瘤细胞；

（2）将阳性杂交瘤细胞腹腔注射乳成年Balb/e小鼠制备抗人糖化白蛋白单克隆抗体，2-4周后，吸取小鼠腹水，离心后吸取上请，用硫酸胺沉淀后，选择蛋白A或蛋白G亲和层析柱进行纯化，得到纯化的抗人糖化白蛋白单克隆抗体。所得的抗人糖化白蛋白单克隆抗体的亲和力很高。抗体的效价大约为1x10⁵，抗体的亲和力大约为1x10^-8M。