[发明专利]水仙BES-SSR标记引物TA34及鉴定水仙品种的方法

权利要求书

1.一种水仙BES-SSR标记引物TA34，由上游引物TA34F和下游引物TA34R组成，其特征在于核苷酸序列如下：

TA34 F: 5'-GCTTTTCGCAAAAGATAGTGAG-3′

TA34 R: 5'-CGTGCCAAATAGTAAGGGGTC-3′。

2.利用如权利要求1所述的水仙BES-SSR标记引物TA34鉴定水仙品种的方法，包括水仙基因组总DNA提取、PCR总反应体系建立、PCR扩增程序、聚丙烯酰胺凝胶电泳条件和PCR扩增产物的检测鉴定，其特征在于：

（1）水仙基因组总DNA提取：利用改良的CTAB法提取水仙基因组总DNA；

（2）PCR总反应体系建立：总反应体系20ul：供鉴定的水仙基因组总DNA 50ng，10×PCR Buffer 2ul，10mmol/L dNTPs 0.5ul，10mmol/L水仙TA34上下游引物各1.0ul，5U/L Taq DNA聚合酶 0.2ul，无菌ddH₂O 12.8ul；所述供鉴定的水仙，本发明共提供24份水仙品种样品；

（3）PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃ 延伸45s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳条件：1×TBE电泳缓冲液，体积比为8%的聚丙烯酰胺凝胶，在电压400V，电流100mA下电泳3.0h后用银染法染色，经ImageScanner Ⅲ凝胶扫描仪扫描保存；

（5）PCR扩增产物的检测鉴定：利用水仙BES-SSR标记引物TA34，对24份水仙的样品进行品种鉴定，于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为290bp的位置出现DNA条带，则该品种为中国多花水仙金盏银台；在分子量为209bp的位置出现DNA条带，则该品种为中国多花水仙重瓣玉玲珑；在分子量为298bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Replete；在分子量为233bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋小冠水仙Alltruist；在分子量为235bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋多花水仙Jetfire；在分子量为168bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Tahiti；在分子量为282bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋裂冠水仙Orangerie；在分子量为189bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Yellow Cheerfulness；在分子量为303bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋红口水仙Recurvus ；在分子量为276bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋多花水仙Erlicheer ；在分子量为161bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋三蕊水仙Thalia；在分子量为234bp 的位置出现DNA条带，则该品种为西洋喇叭水仙Mount Hood；在分子量为177bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋多花水仙White Favourite；在分子量为 273bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋长寿花水仙Silver Smiles；在分子量为281bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Pink Charm；在分子量为197bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Johann Strauss；在分子量为194bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋小冠水仙Barret Browning；在分子量为293bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋喇叭水仙Dutch Master；在分子量为281bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Fortissimo；在分子量为205bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Daydream；在分子量为270bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Gay Tabor；在分子量为296bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋仙客来水仙Tete-a-Tete；在分子量为214bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Bella Vista；在分子量为274bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Carlton。