[发明专利]一种能够减小微量核酸物质整体扩增时产生偏倚的扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸物质扩增方法，特别涉及一种能够减小微量核酸物质整体扩增时产生偏倚的扩增方法。

背景技术

随着生命科学研究的不断深入，单细胞水平的分析越来越重要。一方面，由于细胞之间的异质性，一些大量细胞的平均数据并不能真正代表细胞水平上发生的变化，而且往往会掩盖单细胞水平的信号，例如只存在于少数细胞(如早期癌细胞)中的突变等；另一方面，在一些原材料非常稀有的实验中，例如胚胎早期细胞、循环肿瘤细胞和穿刺得到的样品等，很难获得足够进行测序或其他分析的大量细胞。

为了对单个细胞进行测序等分析，必须首先利用包括PCR、MDA、RCA在内的整体扩增技术生成大量的DNA拷贝。然而这些技术存在的一个缺点是：进行整体扩增时，基因组的某些部分相比另一些会生成更大量的拷贝，这会导致基因组中生成拷贝数较少的区域被淹没，从而无法被检测到。这一问题被称作扩增偏倚。扩增偏倚在现有的全基因组扩增方法中广泛存在，并成为重要的不足之处，原因在于扩增偏倚会导致最终产物无法代表片段的起始相对含量，造成错误的染色体倍型和基因拷贝数估计，并且会造成一些片段由于扩增倍数过少而无法在产物中进行检测，使得单细胞分析无法准确进行。此外，在单分子扩增中，由于起始核酸的含量过少，微量的周围环境中的核酸分子或者操作者带入的核酸分子都很容易混入扩增体系中造成污染。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种能够减小微量核酸物质整体扩增时产生偏倚的扩增方法，其特征在于，将所述核酸物质随机分散到若干互不连通的独立反应体系中后再进行扩增，扩增使用的引物序列中包含3-20个随机碱基，随机碱基随机选自A、G、C、T中的二个、三个或四个。

在传统的大体系(通常指1μL以上，可以直接用移液枪进行操作的体系)单细胞扩增中，单细胞中每个核酸分子或片段在全基因组扩增等同于单分子的扩增，单分子扩增反应的是否启动与何时启动是一个随机过程。一旦一个分子的扩增被随机“启动”了，该分子在短时间内就能够获得高于其他未启动分子数倍的拷贝，而这个数目上的优势则进一步增加了其继续被“启动”的概率，并造成本该属于其他分子的扩增原料被拷贝数较大分子的扩增反应所占用，使得最终产物中某些分子的拷贝数远远大于其他分子，产物中核酸分子拷贝数的比例不能真实反应原料中相同分子的拷贝数比例，这就造成了扩增偏倚。而在本发明的方法中，将待扩增的分子随机分散到若干独立反应体系中，使得每个反应体系中的分子数符合泊松分布，只有0个至50个分子，甚至0-20个，或0-10个以下分子。即便某个分子率先“启动”并获得了较多的拷贝，受其影响的也仅是处于同一反应体系的其他分子，而其他反应体系的分子仍能获得扩增机会。此外，虽然每个反应体系中的单分子扩增的“启动”时间有先有后，但由于每个反应体系中用于扩增的原料是有限的，率先“启动”且扩增速度较快的分子的扩增速度在一段时间后会趋于平稳。当扩增时间足够长，使得反应体系的反应都趋于平稳时同时停止所有的反应体系中的反应，此时理论上所有的分子扩增的倍数应是相同的，从而达到均匀扩增的目的。同时，由于将待扩增的分子分散到了若干个反应体系中，污染物对整体反应的影响就相应的减少了。

进一步的，本发明中扩增使用的引物可以为由3-20个随机碱基组成的序列，随机碱基随机选自A、G、C、T中的二个、三个或四个。本发明的核酸物质的序列可以为未知的。传统的PCR方法中要求被扩增片段至少具有一部分已知序列，再根据这段已知序列设计能够结合在其上的一个或者多个特定序列作为引物。而本发明的方法使用由随机碱基组成的序列作为“随机引物”，由于其随机性可以拥有大量的组合，因此该引物可以和相应长度的未知序列的未知片段进行碱基配对，从而作为引物扩增出未知序列的任意部分，达到未知序列的整体扩增效果，从而允许对未知序列进行全基因组的扩增、测序。根据实验需要，引物中可以包含非自然或者修饰过的碱基，以及与碱基作用的其他物质，例如锁核酸、5′-硝基吲哚、硫代磷酸寡核苷酸等。