[发明专利]感染中四小麦条锈菌新菌系T4的快速分子检测方法

权利要求书

1.小麦条锈菌新毒性菌系T4的特异性RAPD标记的筛选和特异性引物的设计，其特征在于：

根据小麦条锈菌新菌系T4 DNA序列的特性，筛选到两个特异性RAPD标记S1311（5′ CTGCCACGAG  3′）和S1363（5′  GGCTGTGTGG 3′），利用这两个引物能稳定的扩增出条锈菌T4的特异性条带，经过对特异性条带进行回收、纯化、克隆并测序，其特异性条带的长度分别为999bp和821bp：据此，设计并开发特异性SCAR引物，成功地将特异性RAPD标记转化为小麦条锈菌新菌系T4稳定的SCAR标记；

特异性SCAR标记的碱基序列：

T4SP8-1:  5′ GGGCGTGGATGAAGAG 3′

T4SP8-2:  5′ GGAGCAGAAGCAGGTTT 3′。

2.小麦条锈菌新毒性菌系T4快速分子检测体系的建立，权利要求1所述必须遵循以下程序：

 提取田间小麦叶片或采集的小麦条锈菌夏孢子基因组DNA；

 利用以下优化体系进行扩增：15μL反应体系分别在PCR中依次加入：10×Reaction Buffer 1.5μL、25mmol/L 的MgCl₂ 0.9μL、10mmol/L dNTP_S 0.3μL、10ng/μL的T4SP8-1和T4SP8-2引物各1.0μL、50ng/μL模板DNA 1.5μL、5U/μL 的Taq DNA聚合酶(Fermentas公司) 0.15μL、最后用无菌ddH₂O补齐至15μL；

离心10Sec，将PCR管放入PCR仪中扩增；

扩增反应在伯乐S1000 PCR热循环仪上进行，扩增程序为：94℃ 预扩增5min；然后 94℃ 1 min、50.5 ℃ 1 min、72℃ 90 sec，共34个循环；72℃ 延伸10 min，4℃终止反应，扩增完成；

PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液电泳分析，电泳结束后用ULTRA-URLET PRODUCTS凝胶成像系统记录分析；大约在700bp处出现毒性菌系T4的特异性条带。