[发明专利]基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的方法，具体是一种亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列、含有该基因的重组载体、重组菌以及利用该重组菌产生该基因的表达产物及其应用。

背景技术

亚硝酸盐还原酶是一类催化亚硝酸盐还原的酶。亚硝酸盐广泛存在于腌制食物或饲料中。食品中亚硝酸盐含量过高，会使体内血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，降低血液载氧能力，造成高铁血红蛋白血症，对人体造成严重危害。亚硝酸盐还可在人体内与仲胺、叔胺和氨基化合物反应形成强致癌物亚硝胺化合物，从而诱发消化系统癌变。鉴于土壤和食品中超标亚硝酸盐盐污染可引起环境与食品安全问题，人们正在努力寻找有效控制或降解亚硝酸盐的方法，生物酶法成为消除食品亚硝酸盐的一条切实可行的途径。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法，克服现有技术中由于亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本发明所述的亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列长度为2415个碱基对，编码804个氨基酸，分子量约为88.0KD。

本发明涉及一种基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法，将测序得到的亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列(Bm-Nas D)通过引物序列扩增并连接到大肠杆菌表达载体中，从而获得重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。

所述的测序是指：以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳检测；并将扩增产物切胶回收后连接到pMD19-T(Simple)载体上进行测序。

所述的引物序列扩增采用的引物为PCR扩增采用的引物的5′端分别设计了EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体，即：

正向引物Nas D-Eco R I-F：5′-CGGAATTCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3′，以及反向引物Nas D-Stu I-R：5′-AAGGCCTTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3′组成。

所述的大肠杆菌表达载体为pET-41a载体。

所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述的巨大芽孢杆菌NCT-2(Bacilus megaterium)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学微生物研究所；保存日期为2011年3月21日，保藏编号为CGMCC No.4698。

所述的重组表达载体是指：重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas D。

所述的转基因重组菌是指：含有重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas D的大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明涉及上述亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列的应用，将其用于表达目的蛋白产物。

技术效果

本发明与现有技术相比，具有以下优势:

1、本发明提出一种全新的亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列；

2、本发明通过构建重组表达菌株，实现了目的蛋白的外源表达，可以显著提高表达量；

3、本发明采用Western Blot技术，可以对表达蛋白进行灵敏检测，可检测低至1-5ng(最低可至10-100pg)的蛋白。

附图说明

图1PCR扩增电泳示意图。

图2含有重组质粒pET-41a-Bm-Nas D的DH5α平板示意图。

图3重组表达质粒酶切电泳示意图。

图4重组菌诱导表达目的蛋白的SDS-PAGE示意图。

图5重组菌诱导表达目的蛋白的Western Blot-His·Tag图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

巨大芽孢杆菌(Bacilus megaterium)NCT-2的培养