[发明专利]miR-218模拟物、其应用以及一种筛选能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术的应用领域，特别涉及一种miRNA的应用。 

背景技术

胶质瘤是临床上最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，约占所有原发性颅内肿瘤的45%左右。按胶质瘤的恶性程度分为I－IV级，级别愈高，其恶性程度愈大。在所有胶质瘤病人中，25%～50%的为II级；50%～75%的为III级；75%～100%为IV级。恶性度高者瘤内常有坏死与出血，血管丰富，血管外层及内皮细胞均有明显增生，除手术切除外，胶质瘤的药物疗效和放疗效果都不甚理想，因此胶质瘤是疗效最差的恶性肿瘤之一，据统计，胶质瘤病人的一年总生存率低于30%，级别高的病人中位生存期只有大概15个月。胶质瘤预后差的一个主要原因为胶质瘤的高度侵袭能力，恶性程度高的胶质瘤呈浸润性生长，肿瘤成份与正常脑组织的分界模糊，手术往往不能将肿瘤组织完整切除，术后胶质瘤的复发率较高。复发的胶质瘤中，超过90%起源于手术区的浸润瘤细胞或手术区边缘的癌细胞。理解胶质瘤的迁移机制，寻找和发现新的胶质瘤发生、发展和预后密切相关的基因和信号途径对于胶质瘤的分子干预具有重要的意义。 

原癌基因Bmi1（B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site1）是在1991年首次被报道，属于多梳基因家族（Polycomb Group genes，PcG）成员，是与细胞周期转换和细胞增殖相关的重要转录抑制因子，直接参与细胞生长、增殖的调节，Bmi1基因在多种恶性肿瘤如胶质瘤、肺癌、白血病、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等中大量表达，并且与这些肿瘤的侵袭、转移、预后密切相关。INK4a/ARF是Bmi1基因调节细胞增殖和老化的靶点，在Bmi1缺陷的小鼠成纤维细胞（MEF）和淋巴细胞中，INK4a/ARF表达水平明显升高，相反，Bmi1过度表达的MEF细胞中INK4a/ARF蛋白下调，细胞可发生永生化，所以Bmi1通过抑制INK4a/ARF基因的表达来维持细胞的自我更新。Bmi1在人胶质瘤细胞中高表达，并且敲除Bmi1的胶质瘤细胞在体成瘤能力减弱。 

MicroRNA（miR，也称miRNA）是一类长度为20-25核苷酸的非编码的单链RNA，是由具有发夹结构的约70-90个核苷酸大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，通过与mRNA互补结合在转录后水平抑制靶基因的表达， 参与调控心脏疾病、血管疾病、神经和肿瘤等多种疾病的发生和发展过程。肿瘤的侵袭性是区别恶性肿瘤和良性肿瘤的重要生物学特征，也是目前恶性肿瘤难以治愈最终导致死亡的重要原因，因此研究肿瘤侵袭的调控机制一直是肿瘤领域的主要方向。但是肿瘤的侵袭是一个多基因参与的复杂调控过程，所以能够同时调控多个靶基因表达的mircoRNA自从发现之日起就成为了肿瘤发生和侵袭过程中研究热点。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的筛选方法，该方法工艺简单，成本低，应用该方法成功筛选并验证了miR-218模拟物具有抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭的效果，从而达到抑制胶质瘤的目的。 

本发明的第一方面，涉及一种RNA分子miR-218模拟物，其碱基序列包含miR-218核酸序列“茎-环”结构的发夹状结构，主序列如下：5’-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’（SEQ ID NO.3）。 

本发明的第二方面，涉及根据本发明第一方面的RNA分子miR-218模拟物在抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物中的应用。 

本发明的第三方面，涉及一种筛选能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭药物的方法，其中所述药物为miRNA或其模拟物，步骤包括： 

（1）利用定量PCR法检测待筛选药物对Bmi1转录水平的抑制作用； 

将待筛选药物转染胶质瘤细胞后利用trizol法提取总RNA，消化DNA后，利用反转录试剂盒反转录成cDNA，定量PCR法检测Bmi1转录水平。 

扩增Bmi1的引物如下： 

Bmi1基因上游引物Bmi1-F：GCTTCAAGATGGCCGCTTG（SEQ ID NO.1）， 

Bmi1基因下游引物Bmi1-R：TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC（SEQ ID NO.2）； 

（2）利用划痕法对胶质瘤细胞的迁移进行检测； 

（3）利用transwell法对胶质瘤细胞的侵袭进行检测。