[发明专利]一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，更尤其是来源于A.oryzae和A.flavus的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其表达与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

蛋白酶是具有催化蛋白水解生成胨、腙、多肽、氨基酸的一大类酶。蛋白酶按作用方式可分为内外肽酶；按活性中心分为丝氨酸蛋白酶，巯基蛋白酶，金属蛋白酶和羧基蛋白酶；按照蛋白酶来源分为植物，动物，微生物蛋白酶。其中丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用。丝氨酸蛋白酶家族成员非常庞大，分为81类，如胰脏分泌的消化胰酶蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、血液凝固中的凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶以及氨肽酶等都属于丝氨酸蛋白酶家族。丝氨酸蛋白酶活性部位都含有Ser、His、Asp，并具有相同的催化机制，但是他们与底物结合部位的差异决定了各自对底物的专一性，正由于这种结构上微小变化，从而引起其在功能上的差异。并且，由于丝氨酸蛋白酶在结构上全为β蛋白，核心结构由两个非常相似的结构域（N结构域和C结构域），这两个结构域在结构上的差异导致它们在功能和进化上的作用差异。脯氨酸特异性内切蛋白酶，也称脯氨酰内肽酶（proline specific endoprotease,prolyl endopeptidase，简称PEP）[EC.3.4.21.26]或脯氨酰寡肽酶，属于丝氨酸蛋白酶中一种新的家族，该家族能专一性地水解多肽中脯氨酸残基的羧基端肽键，含有典型的丝氨酸蛋白酶家族的G-X-S-X-G/A高度保守序列，但是活性位点Ser周围的氨基酸残基和其他典型的丝氨酸蛋白不同，而且与已知的丝氨酸蛋白酶家族（包括胰蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶Y）相比，在一级结构上同源性很低。

脯氨酸（Pro）是唯一具有亚氨结构的氨基酸，其环状结构影响了与其它氨基酸形成肽键时的空间构象。脯氨酸特异性内切蛋白酶对Pro在多肽中的位置和成键的构型都有很强的专一性，且能够特异性水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽键。因此，可以应用于食品工业、医药、多肽工业等领域；同时可以作为一种分子生物学的工具酶，应用于蛋白质序列测定，肽谱分析、特异位点的酶切、肽链的修饰以及加工等。

特别地，在食品工业方面，由于蛋白质水解产物可以为特定人群提供营养补充，因此有广泛的市场效应。来自乳清产品特别受欢迎的原因在于其极好的口感及良好的可溶性。但是，目前这些酪蛋白水解产物还未获得广泛的流行，缺乏市场渗透力的主要原因在于酪蛋白水解过程中所产生的苦味，这种出现苦味的情况代表了一个技术问题，目前在食品工业上还没有解决。但是可以确定的是苦味通常是很多蛋白质的水解产物，研究表明，苦味和几个特别的苦味肽相关，而不是大量的普遍的苦味肽。Matoba发现水解氨基酸C末端或N末端位置的肽类可以出现较少的苦味，而水解氨基酸涉及肽键两端的肽类的苦味则更多。酪蛋白富含疏水性氨基酸尤其是脯氨酸，Caprralla发现水解产物显著脱苦味伴随着疏水肽类出现的选择性降解。众所周知，包含脯氨酸残基的肽键很难被已知可购买的工业用酶切开。脯氨酸残基在肽的羧基末端的高发生率与低的苦味相关，并且证明了羧基末端脯氨酸残基预期的高发生率只能用高浓度的脯氨酸特异性内切蛋白酶来实现。

因此，在食品工业中，脯氨酸特异性内切蛋白酶不仅在解除直接与抑制苦味相关的苦味肽获得优质的蛋白质水解产物应用显示出了无以伦比的优越性，还在不直接与抑制苦味相关，比如将减少食物蛋白质的变应原性；减缓所得生面团制作面包的腐败；生成富含脯氨酸的肽作为各种食物或营养产品的理想添加剂，以增强蛋白质利用。尤其引人注目的是，该酶还可以用于啤酒酿造,解决啤酒实际生产过程中的冷混浊问题。主要是因为大麦蛋白质中富含脯氨酸序列很丰富，且在他们非发芽的形式时谷类蛋白质是极其难以降解成生产适当的可发酵的麦芽汁所必需的游离氨基酸。