[发明专利]一种提高酶热稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高酶热稳定性的方法，特别是一种利用双亲短肽融合表达提高重组酶的热稳定性的方法。

背景技术

双亲短肽是具有亲水和亲油能力的小分子肽，广泛存在于膜蛋白及脂肪代谢相关酶类的结构中。其双亲的特点能够帮助酶分子与疏水性底物结合、实现酶分子的定位等。

生物活性酶在工业生产中具有广泛的应用，而提高酶的热稳定性是工业酶的研究重点之一。目前，提高酶热稳定性的方法主要包括：1.定向进化：通过定点突变，随即突变，饱和突变等技术，筛选得到热稳定的突变株；2.从嗜热微生物中筛选热稳定性的酶。但是，这些方法并不适用于所有酶分子热稳定性改造中。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高酶热稳定性的方法，通过在重组酶的N端或C端融合表达双亲短肽实现酶热稳定性的提高。

为解决上述技术问题提供如下技术方案：

第一步双亲短肽基因的获得

根据双亲短肽的氨基酸序列，化学合成相应的DNA序列，并将其克隆至大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)的Nde I和Nco I酶切位点之间上，构建成为pET-22b(+)/AP质粒；

第二步融合双亲短肽的重组酶表达质粒的构建

将重组酶基因克隆至pET-22b(+)/AP质粒的Nco I和Hind III位点之间。构建成为表达融合双亲短肽的重组酶表达质粒pET-22b(+)/AP-enzyme。

第三步融合双亲短肽的重组酶表达菌株的构建

将重组质粒pET-22b(+)/AP-enzyme转化宿主大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))，构建高效表达目的酶的诱导型大肠杆菌基因工程菌。

菌株经培养表达目的酶的方法为：

培养基组成(g/L)：

种子培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5；

发酵培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。；

各组分溶解后高压灭菌；冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH₂PO₄/0.72mol/L K₂HPO₄的溶液(2.31g的KH₂PO₄和12.54gK₂HPO₄溶在足量的水中，使终体积为100mL；高压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌)；

培养方法：种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，当OD₆₀₀达到0.6时，将培养温度降为16℃，同时加入终浓度为1.0mM的诱导剂IPTG。

目的酶热稳定的测定方法：

将目的酶分别应用疏水层析、离子交换层析等分离手段，得到电泳纯的目的酶。将目的酶在一定温度下保温，测定酶活相比初始未保温时损失50%所需要的时间(T1/2)。

本发明提供了一种提高酶热稳定性的方法，应用双亲短肽融合表达重组酶能够提高目的重组酶的热稳定性。该方法具有效果显著、工艺简单、便于推广。本发明为快速提高工业酶热稳定性提高了新的方法和思路。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

材料和方法：所用限制性内切酶，T4DNA连接酶，PCR试剂，DNA Marker等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109，引物，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司。

实施例1：双亲短肽的氨基酸序列并克隆至质粒pET-22b(+)

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