[发明专利]一种分型检测腺病毒中和抗体的方法以及用于分型检测腺病毒中和抗体的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种分型检测腺病毒中和抗体的方法以及用于分型检测腺病毒中和抗体的试剂盒，具体涉及一种以一种人血清型腺病毒的三聚体形式的knob蛋白为抗原分型检测所述血清型腺病毒的中和抗体的免疫学新方法，以及以所述血清型腺病毒的三聚体形式的konb蛋白作为中和抗原的分型检测试剂盒。 

背景技术

腺病毒自上世纪五十年代发现并成功分离，至今已经陆续发现了百余种腺病毒血清型，其中人腺病毒有57种血清型（Ad1-Ad57），分为A、B、C、D、E、F、G七个亚群^[1,2]。腺病毒的衣壳为二十面体结构，由240个六邻体（hexon）、12个五邻体（penton）以及12根纤维蛋白（fiber）构成^[3]，并编码主要的病毒中和表位。其中，12根纤维蛋白以五邻体蛋白为基底由衣壳表面伸出，其顶端形成三聚体形式的头节区（即knob蛋白），纤维蛋白有亚群和血清特异性，含有负责体外血细胞凝集的种属特异性抗原决定位点。头节区可以与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染中起着重要的作用^[4]。 

腺病毒长期存在于人群中，可通过人、水、媒介物和器械传播。腺病毒的感染和传播具有地域和性别差异，部分血清型在儿童和军营人员中更易发生感染和大规模流行，大多数婴幼儿在出生后的5年内至少感染过1种腺病毒血清型。腺病毒常在咽、结膜、肠道及淋巴组织内繁殖，并导致各种各样的临床症状，如呼吸系统的感染、结膜炎、胃肠炎、肝炎、出血性膀胱炎、神经系统的紊乱等。腺病毒在有免疫力的宿主体内感染是温和的，而且具有自限性^[5]。体液免疫在腺病毒感染的免疫应答中起重要作用，有腺病毒血症的造血干细胞移植 （HSCT）接受者，在免疫应答清除病毒的过程中会产生高水平的血清型特异性抗体。根据人群血清特异性抗体调查和病毒分离，可知腺病毒感染十分广泛，而且不同血清型的感染程度及地域差异较大。包括中国在内的许多国家很少有实验室对腺病毒进行常规检测，更少进行分型检测。直到目前血清型和亚群特异性的抗体仍只能通过病毒中和实验和血凝抑制法检测。 

随着免疫学、分子病毒学、分子生物学等各个学科的快速发展，以腺病毒作为载体在基因治疗和疫苗开发中的应用已成为研究的热点。由于腺病毒载体外源基因容量大、宿主范围广泛、制备工艺简便、产毒滴度高、基因组不与宿主细胞重组等优点，使得腺病毒成为基因治疗的理想载体而被广泛研究。目前应用最多的腺病毒载体是人血清5型腺病毒（Ad5），它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒（HIV）疫苗的研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。然而，重组5型腺病毒（rAd5）的一个主要问题是人体针对载体本身存在十分普遍的预存免疫，即人体内较高的针对Ad5的中和抗体水平会显著地降低腺病毒载体的转导效率和转基因表达水平。另外，临床研究发现当机体存在中和抗体时免疫腺病毒载体疫苗甚至可能引发意外的安全风险。最新的流行病学研究表明：我国及欧美国家Ad5中和抗体的血清阳性率为60-80％，而在非洲的撒哈拉和东南亚的部分地区高于90％^[6-8]。除了预存免疫问题，rAd5可以说是一种几乎完美的基因治疗和疫苗载体。为了克服预存免疫问题，多个人稀有血清型腺病毒如Ad26、Ad35、Ad48等已被开发改造为疫苗和基因治疗载体并进入临床研究^[9,10]。然而部分血清型腺病毒的全球流行病学研究显示，不同血清型的感染程度具有明显的地域差异，所以新开发的稀有血清型腺病毒载体同样可能面临预存免疫问题。因此，在一种新的腺病毒载体疫苗或基因治疗药物被使用以前，对应用人群进行腺病毒中和抗体水平的检测将十分有必要。另外，以不同血清型腺病毒为载体的疫苗和基因治疗药物在临床前研究时也需要对实验动物进行腺病毒中和抗体的检测。随着生物、化学发光技术的进步，定量的病毒中和实验方法已被建立起来。其策略主要是通过构建病毒载体表达各种发光报告基因，而血清中存在的中和抗体能阻断携带报告基因的重组腺病毒对人 胚肾细胞293（HEK293）等细胞的感染，再通过发光底物对该报告基因表达的受抑制程度做出定量，从而可以对血清样本中中和抗体的存在情况进行检测。病毒中和试验是当前分型检测人血清中腺病毒中和抗体滴度的标准方法。然而该方法成本较高、病毒载体的操作难度大、且受限于一些复制异常的病毒，因此目前仅限于实验室研究，且难以实现对所有血清型病毒的检测^[11]。因此，迫切需要一种更简单、全面的方法分型检测腺病毒中和抗体，以指导新的疫苗和基因治疗载体的开发和临床研究。利用分型中和抗原建立免疫学方法来检测血清中的中和抗体是一种十分理想的检测手段，但至今尚未发现理想的分型抗原及分型中和抗原。