[发明专利]一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞保存技术领域，尤其涉及一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用。

背景技术

对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义，尤其是免疫细胞用于回顾性研究时更为重要。冷冻保存免疫细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时间较长，需要多次诱导和患者多次采血的问题，还可以把人健康状态最好战斗力最强时期的免疫细胞保存下来，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。

影响免疫细胞冻存和复苏活性的主要因素包括冷冻及复苏的方式和冷冻剂的选择。造成细胞损伤的两种因素一种是细胞内冰晶形成和重结晶，一般是由不适当的降温和复温导致；另一种是溶质损伤，一般是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所致。免疫细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。冷冻保护剂可以避免冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤。细胞冻存常用渗透性保护剂，有甘油和二甲基亚砜（DMSO）两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，DMSO可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。目前国内冻存方法多采用的是DMSO、动物血清和细胞培养液按不同比例搭配成的冻存液，优点是细胞保存时间长，缺点是冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性，会对人体过继免疫治疗产生一定影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用，该免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响；本发明的免疫细胞冻存液能够有效的保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

在第一方面，本发明提供一种免疫细胞冻存液，其包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。

本发明的免疫细胞冻存液用人供体血浆代替动物血清，不但避免了引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性；而且用人供体血浆保存供体自身的免疫细胞，比用动物血清保存人免疫细胞能够更好地保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性。

本发明的免疫细胞冻存液并不排除其它成分的存在，比如生理盐水等。

优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10%二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基。

本发明的免疫细胞冻存液按体积百分比二甲基亚砜的含量比如可以是5%、6%、7%、8%、9%或10%等，优选10%。

本发明的免疫细胞冻存液按体积百分比人供体血浆的含量比如可以是10%、12%、15%、20%、24%、28%、32%、40%、50%、60%、70%、80%、85%或89%等，优选10%。

本发明的免疫细胞冻存液按体积百分比免疫细胞基础培养基的含量比如可以是0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%等，优选80%。

更优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比由5-10%二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基组成，即仅含有上述体积百分比的三种成分。

进一步优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10%二甲基亚砜、10-40%人供体血浆和50-80%免疫细胞基础培养基。

更进一步优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含10%二甲基亚砜、10%人供体血浆和80%免疫细胞基础培养基。

本发明的免疫细胞冻存液中，所述免疫细胞基础培养基选自opTmizer^TMCTS^TMT-Cell Expansion SFM培养基或RPMI-1640培养基，可购自美国GIBCO公司。

在第二方面，本发明提供如第一方面所述的免疫细胞冻存液的制备方法，所述方法包括将所述二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基混合的步骤。

本发明对制备人供体血浆的方法不限，比如可以通过如下方法制备：将抗凝外周血于2000-2500rpm离心15-20min，吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃保持30min，然后2000-2500rpm离心5-10min，取上清，即自体血浆，4℃保存备用。