[发明专利]巨大芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶共表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种巨大芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶共表达载体，其特征在于，其核苷酸序列由亚硝酸盐还原酶大亚基Bm-Nas D，如Seq ID No.1所示，以及亚硝酸盐还原酶小亚基Bm-Nas E，如Seq ID No.2所示组成。

2.一种pETDuet-1质粒，其特征在于，包含权利要求1中所述的亚硝酸盐还原酶大亚基Bm-Nas D和亚硝酸盐还原酶小亚基Bm-Nas E。

3.一种根据权利要求1所述的共表达载体的构建方法，其特征在于，首先测定巨大芽孢杆菌全基因组序列作为模板，根据设计出的PCR引物扩增出含有酶切位点亚硝酸盐还原酶大亚基(Bm-Nas D)和小亚基(Bm-Nas E)的基因序列，并依次连接到共表达载体pETDuet-1上，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的大肠杆菌DH5α的阳性克隆。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的依次连接包括：

1）将Bm-Nas D基因连接到pETDuet-1共表达载体上；

2）将Bm-Nas E基因连接到pETDuet-1-Bm-Nas D重组载体上。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征是，所述的PCR引物由

用于将Bm-Nas D基因并分别连接到pETDuet-1共表达载体上的

正向引物Nas D-BamH I-F:

5'-CGGGATCCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3'，以及

反向引物Nas D-EcoR I-R:

5'-CGGAATTCTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3'，和

用于将Bm-Nas E基因连接到pETDuet-1-Bm-Nas D重组载体上的

正向引物Nas E-Kpn I-F:

5'-GGGGTACCATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3'，以及

反向引物Nas E-Xho I-R:

5'-CCGCTCGAGTTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3'组成。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌DH5α的阳性克隆是指：含有重组表达质粒pETDuet-1-Bm-Nas B-Nas C的大肠杆菌BL21(DE3)。

7.一种根据权利要求3-6中任一所述大肠杆菌DH5α的阳性克隆的应用，其特征在于，将其发酵后修复次生盐渍化土壤。

8.一种涉及上述任一权利要求所述的共表达载体的应用，其特征是，将该共表达载体倒入大肠杆菌BL21(DE3)内，通过加入IPTG进行诱导，使该重组菌表达出具有生物学活性的硝酸盐还原酶，进而优化发酵条件提高硝酸盐还原酶的表达量，最终实现酶制剂法修复次生盐渍化土壤。