[发明专利]一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因突变的检测方法，具体是一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法。

背景技术

BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人类尤文氏肉瘤中发现并克隆确认的，是一个能转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列，因其与CRAF和ARAF具有相当高的同源性，故称其为BRAF。BRAF癌基因编码的BRAF蛋白是有丝分裂原活化的蛋白激酶／细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)途径蛋白，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化剂，在凋亡和增殖过程中起着重要作用，位于MAPK通路入口处，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，调节细胞的生长、发育。近来研究发现，人类的许多恶性肿瘤中都有BRAF基因突变，BRAF作为分子标记在多种肿瘤的发生发展中充当着重要角色。英国肿瘤基因组计划的科学家Davies等对来自于530个不同肿瘤细胞株的基因组DNA进行筛查，结果证实有43株细胞发生了BRAF基因突变。调查显示，大约有65％的结直肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤与该家族中的BRAF突变体有关。BRAF突变后持续性激活MAPK通路，使有丝分裂能力增强，导致细胞异常增殖和分化。

RAF蛋白家族含有三个成员：aRAF，bRAF，cRAF，它们是在细胞外基质表达的一类保守的特异性丝／苏氨酸蛋白激酶，参与了细胞外信号调节激酶(Extracellular Regulated Kinase，ERK)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)的信号级联传导途径。RAF激酶作用与RAS的下游，它的功能是磷酸化并激活MAPK／ERK激酶活性(MEK)。通过激活或者抑制Ras-Raf-MAPK／ERK信号通路，可以调控由于生长因子、细胞因子和激素介导的细胞增殖以及细胞存活。因此，对此通路不适当的激活和／或持续的激活会导致异常的细胞分化、增殖和凋亡，并且还会导致肿瘤的发生。

人们通过在大量不同的恶性肿瘤组织中对BRAF进行测序，鉴定出30个以上单点缺失意义的突变，而大部分都发生在激酶区域。恶性黑色素瘤和甲状腺乳头状癌中有50％含有bRAF突变，低度恶性卵巢癌中有30％，结肠癌中有15％，BRAF突变还存在于更多的癌症中(http：／／www.sanger.ac.uk／genetics／CGP／cosmic／)。而其中90％的BRAF突变都在600位存在缬氨酸被谷氨酸替代的现象(V600E)，这样的突变激活了BRAF激酶，并引起了失控的细胞增殖以及癌症发生。

当人们发现了这一点后，便开始研发生产出一些能够抑制BRAF突变的药物，并且在临床上应用上取得了重要的成果，比如威罗菲尼片(vemurafenib)，能对那些肿瘤表达原癌基因BRAF的病人起到非常好的效果。另一方面，在临床使用抗BRAF药物之前，进行肿瘤组织中BRAF基因型的鉴定是一件非常重要的事情。对病人BRAF基因的突变的金标准检测包括肿瘤组织样本的搜集，Sanger法测序或特异引物PCR法。

基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。但是这种方法有一定的局限性，更多时候会涉及到更加复杂、费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性(single-strand comformational polymorphism，SSCP)和异源双链分析法(heteroduplex analysis，HA)。以下是几种PCR衍生技术及经典突变检测方法。

1、PCR-SSCP法：