[发明专利]混合中性纤维素酶及其制备方法和在造纸打浆中的应用

说明书

技术领域：

本发明属于酶制剂领域，特别涉及纸浆造纸领域用酶。

背景技术：

制浆造纸工业是国民经济的重要支柱产业之一，但也是森林、能源、化学品等资源消耗和环境污染的大户。全球的造纸工业每年要砍伐数亿立方米的林木，而其中约半数变为废弃物又被排回至周围的大气和水流中，给人类生存的生态环境造成了巨大威胁和危害。减少能源和化学品消耗、提高纸浆得率、污水生物处理等都是克服上述困难的根本途径。而生物技术恰恰在这些方面是可以大有作为的。

纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶。习惯上，将纤维素酶分成三类：C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构。Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解β-1，4-糖苷键的纤维素酶。β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。

纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。

1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。协同作用一般认为是内切葡聚糖酶(C1酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由CX酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用C1酶作用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。

影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。张中良等（1997）采用均匀设计Cl12(1210)，以绿色木霉（T.ViriclePers.expr）为菌种，研究了影响产纤维素酶的五大因素对产酶量和活力的作用，认为基质粗纤维含量为40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃条件下培养45h可获得最大产酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g·h。王成华等（1997）也研究了其诱变筛选的里氏木霉91-3的产酶条件，结果表明该菌种以7：3的秸秆粉和麦麸，另添加4%硫酸铵、0.4%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁为最佳培养基，28-32℃为适宜培养温度，30℃为最佳温度，4%为最佳接种量，96h到达发酵高峰。张苓花等（1998）研究了以康氏木霉W-925为出发菌，经诱变后得到的Wu-932纤维素酶高产菌的最佳发酵条件。结果表明，以1：2的麦麸和稻草粉为培养基，5%的接种量，稻草粉碎平均长度3-5mm，初始pH4-5，温度在28-35℃，发酵时间72h为最佳发酵条件。

申请人广东溢多利生物科技股份有限公司提交的一种优化改良的中性纤维素酶MEG1及其基因和应用专利，其申请号：201110362928.0。该发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种优化改良的中性纤维素酶MEG1及其基因和应用。本发明提供了一种优化改良的中性纤维素酶MEG1，发明还提供了编码上述优化改良的中性纤维素酶MEG1的基因，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的优化改良的中性纤维素酶MEG1在中性条件下酶活有很大的提高，并且，通过高拷贝外源基因菌株的筛选，得到能够在反应器中高效表达的生产菌株，进一步满足工业化生产的要求，因此，本发明的优化改良的MEG1可在纺织、洗涤、造纸、饲料中显示出巨大的应用潜力。

混合中性纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的，含有纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等生物活性成分。纤维素酶又含有：(1)外切型葡聚糖酶(C1酶)；(2)内切型葡聚糖酶(Cx酶)；(3)β-葡萄糖苷酶(也称纤维二糖酶，CBH酶)三种组分。

混合中性纤维素酶主要是通过对纤维素内部进行分解，促进（打）磨浆过程中纤维的分丝和帚化，使打浆变得更容易，节省打浆能耗。通过对纤维表面进行改性，对纤维末端进行分化，促进纤维的润胀，同时使纤维表面和末端的羟基和羧基增多，从而增强纤维之间的结合力，达到增强成纸性能、提高成纸品质的效果。

通过生物酶对纤维素的改性，纤维形态起明显有益变化，无论是磨前或者磨后，其纤维表面均有更为明显的分丝帚化，因此浆料的叩解度更易提高，同时表面细纤化有助于提高成纸物理性能和改善留着率，纸张成形时纤维间结合力更强。