[发明专利]重组融合蛋白的KEX2剪切区域

说明书

本申请是申请日为2007年6月21日的、发明名称为“重组融合蛋白的KEX2剪切区域”的中国专利申请200780025987.0(PCT/US2007/014476)的分案申请。

对在联邦政府资助的研究和开发下所作发明的权利的声明

本工作的一部分由美国国防高级研究计划局(Defense Advanced Research Projects Agency，DARPA)合同号W911NF-05-C-0072资助。因此，美国政府可享有本发明中的某些权利。

技术领域

本发明涉及目标蛋白，例如功能性抗体蛋白和工业酶从丝状真菌的增强的分泌和剪切。本发明公开了并入用于蛋白剪切(切割，cleavage)的KEX2区域的融合DNA构建体、载体和融合多肽，以及生产目标蛋白的方法。

背景技术

在真菌细胞中的蛋白质分泌过程中，某些蛋白质被KEX2剪切，KEX2是KEX2或”kexin”家族的丝氨酸肽酶的成员(EC3.4.21.61)。KEX2是高度特异的钙依赖性内肽酶，其在蛋白质分泌的过程中剪切该蛋白质底物中紧邻一对碱性氨基酸(即，”KEX2位点”)C端的肽键。KEX2蛋白通常在其活性位点的组氨酸残基附件包含半胱氨酸残基并被对苯甲酸汞(p-mercuribenzoate)抑制。该组的最初成员，酿酒酵母(S.cerevisiae)的KEX2酶(Fuller等1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1434-1438)在其分泌期间剪切α-因子信息素和杀伤毒素前体。

融合多肽的生产已经在包括大肠杆菌(E.coli)、酵母和丝状真菌的多种生物中被报道。例如，牛凝乳酶已经作为与全长葡糖淀粉酶(GAI)的融合体在黑曲霉(Aspergillus niger)中生产(Ward等1990，Bio/technology8：435-440；USP6,265,204和USP6,590,078)；人白细胞介素6(hIL6)已经作为与全长黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(GAI)的融合体在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中生产(Contreras et al.，(1991)Biotechnology9：378-381)；鸡蛋白溶菌酶(Jeenes et al.，(1993)FEMS Microbiol.Lett.107：267-273)和人乳铁蛋白(lactoferrin)(Ward et al.，(1995)Bio/Technology13：498-503)已经作为与葡糖淀粉酶的1-498残基的融合体在黑曲霉中生产；并且牛凝乳酶已经作为与全长天然α淀粉酶的融合体在黑曲霉中生产(Korman et al.，(1990)Curr.Genet.17：203-212)，并作为与截短形式的米曲霉(A.oryzae)葡糖淀粉酶的融合体在米曲霉(Aspergillus oryzae)中生产(Tsuchiya et al.，(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58：895-899)。也参考Shoemaker et al.，1981Bio/Technology1：691-696；Nunberg et al.，(1984)Mol.Cell.Biol.4：2306-2315和Boel et al.，(1984)EMBO J.3：1097-1102。在这些融合蛋白的一些中，KEX2蛋白酶识别位点(Lys-Arg)已经被插入葡糖淀粉酶和目标蛋白之间(例如，Contreras et al.，1991和Ward et a1.，1995)。本发明的发明人已经发现：当KEX2识别位点已经被操控为包含氨基酸KEX2位点前序列(pre-sequence)时，蛋白分泌和/或蛋白剪切可能在融合蛋白中被增强。