[发明专利]与黄瓜抗、感黑斑病基因紧密连锁的基因片段及抗性鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，涉及黄瓜常规杂交育种、分子标记辅助育种的方法与技术。特别是与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的基因片段、与黄瓜感黑斑病基因紧密连锁的基因片段，鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法。

背景技术

黄瓜（Cucumis Sativus L.）是葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属（Cucumis）一年蔓生草本植物，是全球普遍栽培的主要蔬菜作物，是中国种植面积最大的蔬菜之一。黄瓜黑斑病[Cucumber alternaria leaf spot，Alternaria cucumerina]是近几年发展起来的一种由瓜链格孢菌引起、为害严重的真菌性病害，目前已成为黄瓜保护地、露地栽培的重要病害之一。俗称烤叶病、烧叶病，幼苗、成株均可发病。主要危害叶片，一般先从黄瓜的中、下部叶片开始发生，而后逐渐向上蔓延，最后仅剩下顶端几片绿叶，病株似火烤状。病斑多数沿叶脉两侧的叶肉组织发展，主脉一般不受害。发病严重时多个病斑连成一片，叶肉组织枯死，叶缘向上卷起，叶子焦枯，但不脱落。黄瓜黑斑病一般在4月中旬至5月上、中旬发生，发病率高达60%以上，减产10～20％。结瓜期发病，如果防治不及时，会造成绝产，给种植户造成巨大经济损失。尤其在蔬菜高度产业化的今天，基于传统的抗病育种模式严重制约着黄瓜品种的更新换代、生产产业化的步伐，利用现代生物技术手段进行黄瓜抗病分子标记辅助育种势在必行。

分子标记的应用为蔬菜育种学开辟了崭新的研究和应用领域，它使蔬菜育种学家能直接从分子水平了解物种间的差异,也使育种过程更直观，目的性更强。分子标记辅助选择（Molecular marker-assisted selection，MAS）技术目前已成为育种研究的热点和重要手段，将分子遗传技术应用于蔬菜抗病遗传育种的研究上，为材料的选择提供了全新的手段。可在早代对表现优良的基因型进行鉴定，苗期即可在DNA水平上对目标性状进行选择，抗病性鉴定可在室内完成，鉴定周期缩短到2天，而且稳定可靠，不受季节、环境条件等因素的影响，可提高选择速度，增强选择的准确性和可靠性，加快育种进程，因此具有广阔的应用前景。

随着蔬菜集约化生产和栽培技术的提高，黄瓜抗病育种已提到重要位置。黄瓜黑斑病是黄瓜生产上的重要病害。查阅国内外文献，迄今为止，有关黄瓜黑斑病的分子标记辅助育种研究尚缺乏系统的研究和报道。因而将黄瓜抗黑斑病基因与不抗黑斑病的其它品种的优良品质基因相结合，培育优良抗病的黄瓜新品种和创造黄瓜新种质是生产实践中亟需解决的实际问题。筛选与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的分子标记，获得与黄瓜抗、感黑斑病基因紧密连锁的基因片段，建立黄瓜抗黑斑病分子标记辅助育种体系，将会推动传统的“经验育种”向高效的“精确育种”转变，提升育种效率和技术水平，加速抗病育种的进程，为黄瓜遗传和育种工作奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列。

本发明的第二个目的是提供一种与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的基因片段。

本发明的第三个目的是提供一种与黄瓜感黑斑病基因紧密连锁的基因片段。

本发明的最后一个目的是提供一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法。

本发明的技术方案概述如下：

用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列，它由上游引物和下游引物组成，上游引物是序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，下游引物是序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。

与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的基因片段，是SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。

与黄瓜感黑斑病基因紧密连锁的基因片段，是SEQ ID No.4所述的核苷酸序列。

一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，包括如下步骤：

（1）提取被鉴定样品黄瓜基因组DNA；

（2）以所述黄瓜基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所述核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增；

（3）将步骤（2）获得的PCR扩增产物进行凝胶电泳，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；