[发明专利]基于液质联用检测膜蛋白与配体亲和力的混合物筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种基于液质联用的膜蛋白与配体亲和力测定方法。

背景技术

膜蛋白是生物膜功能的主要执行者之一，所有的细胞和细胞器都由磷脂双分子层所包裹，膜蛋白就与脂双层结合或镶嵌其中。根据膜蛋白在脂双层膜中的分布位置，可将膜蛋白分为外在膜蛋白（peripheral protein）和内在膜蛋白（integral protein）两大类。外在膜蛋白约占膜蛋白的20％～30％，分布在膜的内外表面，为水溶性蛋白；内在蛋白约占膜蛋白的70％～80％，这类蛋白部分或全部嵌入磷脂双层分子中，所以又称跨膜蛋白。内在膜蛋白露出膜外的部分含较多的极性氨基酸，属亲水性，与磷脂分子的亲水头部邻近；内在膜蛋白由于嵌入脂双层内部，主要由一些非极性的氨基酸组成，与脂质分子的疏水尾部相互结合，因此与膜结合非常紧密。据估计，核基因组编码的蛋白质中30%左右的为膜蛋白。通过膜蛋白介导的细胞生物学反应异常涉及到许多危及人类健康的疾病，如肿瘤、心脑血管疾病以及各种炎症反应等。膜蛋白是药物开发的主要靶点，应用于临床药物中有50%药物的靶标是膜蛋白。因此，对于膜蛋白的药物筛选研究有着非常重大的意义。在膜蛋白中，离子通道蛋白以及G蛋白偶联受体家族是最重要也是研究较多的膜蛋白。离子通道蛋白是细胞膜上具有特殊功能的跨膜蛋白质，由于带电的离子不能自由通过磷脂双分子层，只能通过细胞膜上的离子通道进行转运，因此离子通道蛋白在生物体的生命活动中起着至关重要的作用。离子通道膜蛋白结构异常，与许多疾病的发生和发展都有关系，如心脏病，Andersen'综合症以及中枢神经相关的疾病等。

而G蛋白偶联受体则是一类广泛存在真核生物细胞的细胞膜上,体拥有七次跨膜a螺旋(seven transmembrane α-helical fold)的受体，目前已经发现的G蛋白偶联受体已超过800个，不同的G蛋白偶联受体(GPCR)通过和相应的G蛋白(G protein)偶联可以对细胞外多种刺激信号作出反应，在细胞内产生神经传递、味觉、嗅觉、视觉及细胞的新陈代谢、分化、增殖、分泌等一系列生理效应。G蛋白偶联受体中30%是药物靶点，上千种已上市药物中接近一半是针对G蛋白偶联受体的，作用于G蛋白偶联受体的药物对疼痛、认知障碍、高血压、胃溃疡、鼻炎、哮喘等各类疾病均有良好的治疗作用¹。

传统的膜蛋白药物筛选方法大都是通过同位素标记的配体亲和力筛选方法或者通过细胞水平的功能性酶活测试进行。这些方法通常都需要用已知的阳性化合物作为参考。而且，同位素方法使用要求严格，对实验者健康有一定的损害，对环境有一定的污染。对于孤儿受体这些筛选方法都无法应用。另外，功能性酶活检测方法通常需要针对不同的靶标蛋白发展不同的检测方法。

利用液质联用技术检测小分子配体（抑制剂）和水溶性蛋白受体（酶）的亲和力技术文献已有报道，一般而言，液质联用技术检测蛋白和配体小分子相互作用亲和力通常具有高通量，高灵敏度，样品需求量低等特点。也有文献1（Neiels Jonker et al.Recent developments in protein-ligand affinity mass spectrometry Anal Bioanal Chem399:2669-2681(2011)）报道在去污剂存在下应用分子排阻色谱处理样品，随后用质谱进行小分子配体和G蛋白偶联受体相对亲和力测定，或者将G蛋白偶联受体固定在固体表面处理样品后用质谱测定配体相对亲和力）。虽然溶解在去污剂中或固定在固体表面能达到防止G蛋白偶联受体形成聚集体和变性沉淀的目的，但去污剂或固体表面的环境不能真正反映G蛋白偶联受体在生物膜中被磷脂双分子层所包裹的环境，可能使最终的检测结果呈假阳性。将液质联用技术普遍应用于膜蛋白亲和力测定仍然是个挑战，其原因还在于（一）膜蛋白通常要溶于去垢剂中才能稳定，而去垢剂对质谱检测影响较大；（二）对不同的膜蛋白要选择不同的去垢剂，去垢剂选用不合适对检测结果影响也很大。