[发明专利]一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法，属于多糖的结构改造技术领域。

背景技术

多糖是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子物质，广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，具有广泛的生物活性。多糖类物质具有免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗菌、抗疲劳和抗衰老等作用。多糖的生物活性与其结构有着密切的关系，采取一定的方法对多糖分子结构进行适当修饰可以改变多糖活性，提高其功效。硫酸化修饰是多糖修饰中常见的方法之一，由于硫酸基的引入具有了聚阴离子特性，而聚阴离子特性是其生物学活性改变的主要因素，一些天然多糖经过硫酸化修饰后得到了用途更为广泛的多糖衍生物。

方格星虫，素有“海洋冬虫夏草”之称，是一种食疗兼优的药膳，具有显著的延缓衰老、抗氧化、抗疲劳、耐缺氧、耐高温、催乳以及滋阴降火、清肺化痰等功效，对心血管系统也有明显的保护作用。多糖作为方格星虫的主要有效成分，对其生物活性的研究日渐增多，根据文献报道和本申请人的前期工作证明，方格星虫多糖具有抗菌活性，但这种抗菌活性略显不足，因此，寻找一种提高方格星虫多糖抗菌活性的方法，更有利于提高方格星虫的利用价值。对方格星虫多糖进行结构修饰，是提高方格星虫多糖抗菌活性的途径之一，在这方面经过检索没发现有相关技术的披露。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法，针对方格星虫多糖抗菌活性低的问题，对方格星虫多糖结构进行硫酸化修饰，从而提高方格星虫多糖的抗菌活性。

为实现上述目的，本发明采取了下述技术方案，一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法，具体技术步骤是：

（1）方格星虫多糖的纯化

1）纤维素柱层析： 取方格星虫粗多糖进行纤维素柱层析，按常规柱层析操作方法，取方格星虫粗多糖0.5g溶于10mL超纯水上样，用0.3-0.5moL/L NaCL洗脱，流速为1mL/min，得到洗脱液，用玻璃纸透析除去盐分，减压浓缩至温度30℃相对密度是0.9829 g/mL，进行冷冻干燥，得到含水量是1-5%的方格星虫多糖冻干品备用； 

2）凝胶柱层析： 取方格星虫多糖冻干品用超纯水溶解，0.45μm滤膜过滤，按常规方法进行凝胶柱层析，用超纯水以 0.2 mL/min流速洗脱，得到洗脱液，减压浓缩至温度为28℃时测得相对密度是0.9856-0.9918 g/mL，进行冷冻干燥，得到含水量是1-5%的纯化的方格星虫多糖备用；

（2）方格星虫多糖的硫酸化修饰

1）硫酸化试剂制备：  将附有冷凝装置和磁力搅拌的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入10-15 mL的吡啶，较为剧烈的搅拌5-10 min，按氯磺酸与吡啶是1:6-10的体积比，于40min内边搅拌边逐滴加氯磺酸至吡啶中，至出现大量淡黄色固体，反应结束，得酯化试剂备用；

2）硫酸化修饰操作：  精确称取0.500g纯化的方格星虫多糖，混溶于35mLDMF中，以磁力搅拌器搅拌30min混成均匀的悬液，倒入酯化试剂中并搅拌在水浴中使其反应，水浴温度是45-70℃，反应时间是2-4小时，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入预冷至0-4℃的100mL冰水中，用15%的NaOH中和至pH7.0-7.2，加入三倍体积的无水乙醇，静置24h，离心，热水溶解沉淀，流水透析48h，冷冻干燥至含水量为1-2%，得到方格星虫硫酸酯化多糖（sulfated SPS，sSPS）。

采取上述措施的本发明，其中硫酸酯化多糖中糖含量测定采用苯酚-硫酸法；硫酸基含量的测定采用BaCl^2-明胶比浊法，按照标准曲线制作方法测定吸光度，由回归方程计算硫酸基浓度，按下式计算取代度DS：DS=（1.62×S%）/（32-1.02×S%）。将本发明所得方格星虫硫酸酯化多糖进行抗菌活性比较，采用纸片扩散法，以6种细菌（大肠杆菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aures、藤黄八叠球菌Sarcina lutea、副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus和鳗弧菌Vibrio anguillarum）为指示菌，对方格星虫多糖和最优修饰条件所得硫酸酯化多糖sSPS5进行了抗菌活性测定。结果如下表所示：

方格星虫多糖和硫酸酯化多糖对细菌的抑制作用 (mm)