[发明专利]一种培养人胎盘间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种培养人胎盘间充质干细胞的方法。

背景技术

干细胞是一种未分化的细胞，有两个基本特性，一是具有自我复制能力，二是能分化成一种以上的功能细胞，根据分化潜能的大小，干细胞一般分成三类，第一类是全能干细胞（totipotent stem cell），其可以分化为功能一致的全能细胞，可以发育为胎儿；第二类是多潜能干细胞（pturipotent stem cel)，它能够分化为身体中的每种细胞类型，但是不能形成胎盘或胎儿发育所必需的支持组织。由于多潜能干细胞的分化潜能不是“全体”的，因此不将这种细胞称为“全能”，而且它们不是胚胎。多潜能干细胞进一步特化为多能（multiPotent）干细胞，其专用于分化为特定功能特化的特定种系的细胞。多能干细胞能够分化为它们所源自的组织中含有的细胞类型；例如血液干细胞只能够分化为红血细胞、白血细胞和血小板。胚胎干细胞（Embryonic stem cell）具有广泛的潜能，能生成除胎盘外的机体所有的组织细胞；第三类是成体干细胞（aduit stem cell）是一种将拥有终生自我复制（identical copies）和自我更新（self-renewal）能力的未分化细胞，它分布于不同的组织，并可演变成为各种类型的资质细胞。干细胞的分类，主要分为造血干细胞及非造血干细胞。造血干细胞主导血液、免疫方面的疾病，来源例如脐带血；非造血干细胞则以细胞分化与修复为主，可应用于中风、糖尿病、老年痴呆等再生医学，来源有脐带、胎盘、乳牙等。

间充质干细胞（mesenchymal stem cell MSC）是可形成多种细胞类型的多能干细胞。间充质干细胞(MSC)最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。间充质干细胞的应用范围也越来越广泛。目前国内外已开展了多项临床应用研究，主要疾病类型包括骨关节炎疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应（GVHD），脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种培养人胎盘间充质干细胞的方法。

为解决本发明的技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种培养人胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

    （1）取新鲜采集的人胎盘组织，清洗，放入胎盘保护液中2-8℃保存备用，所述的胎盘保护液是在AIM-V培养基中加入青霉素钠和硫酸链霉素得到的，其中青霉素钠和硫酸链霉素在脐带保护液中的终浓度分别为100-200 U/mL和100-200 U /mL；

   （2）取浸泡在胎盘保护液中不超过48小时的人胎盘组织，清洗，再依次置临用新配的青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，最后再清洗后置于一次性无菌培养皿中进行备用；

   （3）将无菌清洗过的人胎盘组织剪成肉糜状，加入AIM-V培养基，置分离管中用全自动组织分离器进行分离，再使用无菌滤网过滤，得胎盘组织细胞悬液；

   （4）将胎盘组织细胞悬液进行离心，弃上清，收集下层，置于培养瓶中，然后向其中加入无血清培养基，置于36-38℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂孵育箱中培养，至观察到瓶壁上形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛时，则获得人胎盘间充质干细胞原代细胞混合液，然后经离心，即可获得人胎盘间充质干细胞原代细胞，再经传代培养至细胞融合度达80-90%即得。

  按上述方案，所述步骤（1）中的胎盘保护液是将注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素预先溶解后再加入到AIM-V培养基（治疗级)中得到的；所述步骤（2）中青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液是将注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素按一定量加入0.9%氯化钠注射液中混合得到的；所述每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液的配制是将注射用两性霉素B先用0.9%氯化钠注射液溶解后，再和一定量的甲硝唑注射液混合得到的；所述人胎盘在青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液中的浸洗时间均为8-12min。