[发明专利]一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于动物类药材制取方法领域，特别是涉及到一种珍珠母炮制前后寡肽分离纯化的方法。

背景技术

动物药是我国医药学的重要组成部分，自古以来就广泛用于防病治病。早在3250到3350年前甲骨文就记载有动物药。《山海经》记载动物药58种，汉代《神农本草经》记载动物药67种，明代《本草纲目》记载440种，《本草纲目拾遗》又增收动物药160种，历代本草中的动物药总数已达600多种，最多收载动物药《中药大辞典》达740种之多。在我国数千年的发展过程中，我们的祖先在同疾病的斗争中，积累了极其丰富的利用动物药防病治病的经验。从动物药中寻找生理活性成分，经广泛的药理筛选和研究开发成新药，可以大大缩短新药开发的周期，降低成本，从而扩大药源。

珍珠母为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶纹冠蚌Cristaria plicata(Leach)或珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteria martensii(Dunker)的贝壳，为常用中药。主要分布于我国江苏、浙江、湖北、安徽等地。本品始载于《开宝本草》“真珠”项下。现收载于《中国药典》2010版一部，具有平肝潜阳，定惊明目，用于头痛眩晕，烦躁失眠，肝热目赤，肝虚目昏。搜集国内外文献可知，国内外学者主要对珍珠母的微结构和晶体的形成做了研究，对其文石和方解石的研究比较多，但对珍珠母中的化学成分研究并不深入。据国内有关珍珠母化学成分的报道，珍珠母的主要成分是碳酸钙，含有少量的微量元素和氨基酸等，对其化学成分研究还不完全，对其活性方面的研究也鲜见报道，这无疑阻碍珍珠母的进一步开发和利用。因此，为了能够更好的应用珍珠母动物药资源，阐明其药效的化学依据，有必要对其化学成分和活性进行系统的研究。经过实验研究，基本确定了珍珠母中含有寡肽类化学成分，而寡肽类化学成分正是当今社会上的研究热点，本发明把研究珍珠母中寡肽类化学成分及其活性作为主要研究内容。据文献报道，珍珠母的应用多为炮制品，但珍珠母炮制前后在化学成分上，特别是有效成分上的变化，却少有报道。所以本发明对珍珠母炮制前后的活性及相应活性成分的变化做了对比分析，从而确定珍珠母炮制前后的有效成分的变化，阐述珍珠母炮制的意义。

2011年2月15日出版的《食品科学》中“合浦珠母贝肉寡肽的制备及其抗氧化活性研究”一文详细阐述了现有技术当中以合浦珠母贝肉为原料,通过酶解技术及超滤、凝胶层析、反相高效液相色谱等分离纯化技术制备具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉寡肽。同时也说明了现有技术当中存在的局限性。

珍珠母与珍珠来源于同一动物，其成分极其相似，功效相同，炮制方法也相同。但珍珠价格昂贵，用它做药源成本太高。珍珠母是一种廉价易得的药材。据报道珍珠母与珍珠在有效成分上是相同的，我们可以用珍珠母代替珍珠作为中药使用，从而节约成本，扩大药源。本发明对珍珠母中寡肽类化学成分进行了分离纯化和抗氧化活性研究，为今后充分利用及合理开发珍珠母动物药资源提供了一定的科学依据。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种珍珠母炮制前后寡肽分离纯化的方法。

一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征在于：

步骤一、取珍珠母超微粉100目～200目生品，即准备用来进行炮制的样品，加入蒸馏水,分数比为超微粉：蒸馏水=1:10，加热至90℃回流提取，滤过，滤液闪蒸浓缩至浓度为65%后，冻干成粉，得到炮制后的珍珠母生品冻干粉；

步骤二、将珍珠母生品冻干粉进行SephadexLH-20凝胶柱分离，检测得到30个流分；分别对30个流分进行薄层分析，分析结果为流分Fr.5～Fr.13的薄层显色是相同的，将薄层显色相同的流分Fr.5～Fr.13合并，将合并后的流分冻干成粉；

步骤三、将步骤二中得到的冻干粉上C8反相柱进行洗脱操作，并采用自动流分收集器收集，收集到波长为220nm、流速为3mL/min、5mL/管的自动接样流分，总共收集到55个流分，色谱图显示有三个一样高的小峰，对该三个一样高的小峰进行薄层分析，分析结果显示为阳性的流分与色谱图相对应，为Pe-30～Pe-35，将Pe-30～Pe-35的流分合并，并将合并后的流分冻干成粉；

步骤四、对步骤三中得到的冻干粉通过反相HPLC色谱分离系统进一步分离纯化,以1‰甲酸乙腈洗脱，选用VenusilASB-C18反相柱，在210nm下检测，经反相HPLC色谱分离，选取时间为5.940min时的色谱峰，该色谱峰为寡肽1即得到珍珠母寡肽1，收集并保留寡肽1样品，将寡肽1样品冷冻干燥，得到寡肽1冻干粉；