[发明专利]用于空肠弯曲菌PCR-ELISA检测的引物组、探针和试剂盒及试剂盒的使用方法

权利要求书

1.用于空肠弯曲菌PCR-ELISA检测的引物组和探针，其特征在于，所述上游引物和下游引物以及探针的核苷酸序列如下：

上游引物：hipO F: 5’-GGGTTTGGGTGGTGCTAAG-3’      ；

下游引物：hipO R: 5’-Biotin-CCACAACAAGCAAAGAAGCAG-3’     ；

探针：5’-GATGATGGCTTCTTCGGATAG-Dig-3’        ；

所述的下游引物5’端为生物素标记，探针的3’端为地高辛标记    。

2.一种含有权利要求1引物组和探针的检测试剂盒，其特征在于，还包括有：PCR(DNA)模板、PCR反应液和ELISA反应液。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR(DNA)模板由增菌培养液培养而成。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括PCR buffer、MgCl₂、dNTP、Taq酶和超纯水。

5.一种空肠弯曲菌PCR-ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

  1） 以包被缓冲液（0.05mol/L 碳酸盐缓冲液，pH9.5）稀释链霉亲和素，包被酶标板，100μL/孔，终浓度为20μg/L，37℃过夜，甩干后以含0.5mL/L吐温20的PBST洗板3次，200μL/孔，每次静置5min，甩干；

2）以含40mg/L脱脂乳的PBS稀释鱼精DNA，封闭酶标板，200μL/孔，37℃ 1h，同上法洗板3次；

3）以PBS将PCR产物做1：50稀释，取100μL加入孔中，37℃固定1h，洗板4次；

4）以1/6体积SSC和0.1% 浓度SDS溶液稀释探针（浓度为50pmol/mL）， 在96孔板中加入100μL含杂交探针的杂交液，55-60℃反应1h，洗板5次；

5）加入100μL以PBS稀释的AKP标记的抗地高辛抗体，37℃ 1h，洗板5次；

6）加入100μL临时配制的pNPP显色液，置37℃避光显色，最后加入50μL 2mol/L NaOH终止液；

7）可用肉眼观察，与阴性对照孔进行比较，hipO基因阳性的孔中显黄色，而阴性应与阴性对照一致；或用酶标仪检测，用显色底物溶液调零，在405nm处测定各孔的吸光值，OD_405nm大于0.17为阳性，小于0.17为阴性。

6.根据权利要求5所述的一种空肠弯曲菌PCR-ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于，生成PCR产物的反应步骤如下：

PCR扩增反应体系：10倍PCR buffer 2.5μL、MgCl₂（25mmol/L）2μL、dNTP（2.5mmol/L）2μL、Taq酶0.25μL、上游引物和下游引物各1μL、模板2μL，超纯水14.25μL，反应条件：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min，各物料的用量可同比例放大或缩小。

7.根据权利要求6所述的一种空肠弯曲菌PCR-ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述模板的制备步骤如下：取0.5 mL增菌培养液于1.5mL EP管中，10000 r/min 离心5min，弃上清，加入100μL 超纯水，漩涡混匀，100℃水浴20min，立即冰浴10min，12000r/min离心5min，取上清，各物料的用量可同比例放大或缩小。