[发明专利]一种汗腺细胞匀浆液诱导骨髓间充质干细胞转变为汗腺样细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及人体汗腺再生研究领域。具体说来，本发明涉及一种在非转基因条件下，利用含汗腺细胞匀浆液的条件培养基诱导成体骨髓间充质干细胞转分化为汗腺细胞的方法。

背景技术

皮肤被覆于身体表面，是人体最大的器官。排汗功能是其众多功能之一，可排出机体25％的热量以保持体温的相对恒定。轻度烧伤时汗腺细胞可以其深部未受创的部分为模板而完全修复，但全层大面积烧伤患者因汗腺被毁或被瘢痕组织堵隔而丧失了分泌汗液的功能，这不仅给患者的生理与心理带来严重障碍，而且对其后期的生活与工作质量将产生严重影响。因此，研究皮肤损伤后汗腺组织的修复与再生，不仅是创(烧、战)伤治疗本身的需要，而且也是重塑人体生理与心理的需要，值得人们关注。

近年来，随着干细胞生物学与再生医学研究的深入，利用成体干细胞及其可塑性为皮肤附属器的再生带来了新的希望。利用骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)再生汗腺主要包括以下优点：一是MSCs本身具有低免疫源性和多向分化潜能；二是MSCs存在于骨髓基质，在大面积创伤、烧伤时受到外界的直接破坏作用比较小；三是储存量比较大，在严重创伤和烧伤条件下能够发生动员，容易获取。基于以上原因，深入开展MSCs的分化调控研究对皮肤汗腺再生策略具有重要的理论意义和应用价值。

我们和他人大量的前期研究已经初步证明MSCs直接参与了皮肤损伤修复与再生的全过程，其中包括：皮肤组织损伤后，造血干细胞和间充质干细胞从骨髓动员到循环细胞池，并迁移到损伤部位。在此基础上，我们实验室又进一步开展了MSCs向汗腺细胞诱导分化的研究工作，目前通过MSCs与热休克汗腺直接共培养技术，已成功将MSCs诱导成为汗腺细胞或汗腺样细胞。但此项技术的缺点是被诱导成为汗腺样细胞的MSCs中混杂有原始的汗腺细胞，因此影响了这项技术在临床治疗上的推广应用。为解决这一技术难题，我们发明了一种汗腺细胞匀浆液诱导骨髓间充质干细胞转变为汗腺样细胞的方法。

发明内容

因此，本发明提供了一种汗腺细胞匀浆液诱导骨髓间充质于细胞转变为汗腺样细胞的非转基因方法，包括以下步骤：

a)分离并培养MSCs，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CD29、CD44和CD105；

b)分离并培养汗腺细胞，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CEA、CK7、CK8和CK19；

c)将上述培养的汗腺细胞通过超声波法进行匀浆处理，之后离心去除细胞杂质，使之形成含汗腺匀浆液的条件培养基；

d)使用上述含汗腺匀浆液的条件培养基诱导MSCs向汗腺细胞的转分化；

优选地，含汗腺匀浆液的条件培养基，浓度为1×10⁵个细胞匀浆液/ml。

优选地，诱导时MSCs的细胞密度为3×10⁵/ml。

优选地，MSCs向汗腺细胞转分化的诱导时间为8天。

附图说明

图1描述了免疫细胞化学法检测MSCs表面标志性蛋白CD29、CD44和CD105的表达。其中(A)为空白对照；(B)为CD29；(C)为CD105；(D)为CD44；bar=100um。

图2描述了免疫细胞化学法检测汗腺细胞表面标志性蛋白CEA、CK7、CK8和CK19的表达。其中(A)为CEA；(B)为CK7；(C)为CK8；(D)为CK19；bar=100um。

图3描述了MSCs转分化诱导后细胞形态的改变。其中(A)为MSCs诱导前的形态；(B)为MSCs诱导后4天的形态；(C)为MSCs诱导后8天的形态；(D)为正常汗腺细胞的形态；bar=100um。

图4描述了MSCs转分化诱导8天后细胞表型的改变。其中(A，B)为诱导前后CEA的表达；(C，D)为诱导前后CK7的表达；(E，F)为诱导前后CK8的表达；(G，H)为诱导前后CK19的表达；bar=100um。

具体实施方式

以下本发明以具体实施例的方式具体阐述发明。本领域技术人员可以理解的是，以下的实施例是为了阐述发明，而非限定发明的范围。

实施例

实施例1MSCs的分离培养及鉴定