[发明专利]环脂肽抗生素罗克霉素生物合成相关的基因簇

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及具有广谱抗菌活性，特别是抗病毒活性的环脂肽抗生素罗克霉素(locillomycin)的生物合成、分析、功能研究及应用。 

技术背景：

脂肽类抗生素是枯草芽孢杆菌及其相近物种通过非核糖体合成途径合成的一类由亲水性环状短肽头部和长链疏水性脂肪酸尾部组成的次生代谢产物，具有抗菌活性和溶血性能，在医药、农药和工业上具有广泛的应用价值。脂肽类抗生素根据其合成的基因簇和化学结构的差异可分为表面活性素(Surfactin)、伊枯草素(Iturin)和泛革素(Fengycin)三大家簇。 

表面活性素家簇结构的共同特点是由7个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有13～15个碳原子β-羟基脂肪酸交联形成内酯环状结构的极性化合物。表面活性素通过作用于细胞膜的磷脂双分子层而表现出较强溶血活性、抑制细菌和病毒的活性。该家簇主要包括枯草芽孢杆菌产生的表面活性素，短小芽孢杆菌产生的表面活性剂(Pumilacidin)，地衣芽孢杆菌产生的地衣芽孢杆菌素(lichenysin)。由于表面活性素7个氨基酸残基的变异性较大，表现出很强的多样性。 

伊枯草素家簇结构的共同特点是由7个氨基酸残基的多肽链与含有14～17β-氨基脂肪酸链相连形成的化合物。伊枯草素也具有较强的溶血活性，主要是通过影响真菌细胞膜的表面张力，导致微孔的形成、促使电解质及其他重要离子的渗漏而表现出强的抗真菌活性。然而，伊枯草素对细菌和病毒的抑制活性较弱。伊枯草素家簇由枯草芽孢杆菌及其近源菌种合成分泌，主要包括9个异构体IturinA、C、D、E、Bacillomycin D、F、L、Lc和Mycosubtilin。 

泛革素家簇结构的共同特点是由10个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有14～18个β-羟基饱和或非饱和的脂肪酸交联形成内酯环。泛革素的溶血作用没有表面活性素和伊枯草素强烈，但表现出强烈的抗真菌活性和弱的抗细菌和病毒活性。泛革素也主要是由枯草芽孢杆菌及其相近菌种合成分泌，主要包括4中异构体Fengycin A、B和Plipastatin A、B。 

脂肽类化合物合成酶系NRPSs是目前所发现的最大的酶系之一，由多个模块(Module)按一定的空间顺序排列而成，一个典型的模块大约有1000个氨基酸组成，主要负责一次底物缩合反应，负责将一个氨基酸整合到延伸的肽骨架上。每个模块一般都含有氨基酸腺苷酰化(amino acid adenylation domain，A)、肽酰载体蛋白(peptidyl carrier protein doamin，PCP)、和缩合(condensation domain，C)三个基本结构域。上述基本结构域将氨基酸整合 到肽骨架的具体过程是：1)A结构域从底物池中选择结合特定的氨基酸，在ATP的作用下将底物活化；2)活化的底物，氨酰-AMP与PCP结构域上的辅因子磷酸泛酰巯基乙胺(4′-phosphopantetheine，Ppant)的巯基结合，形成氨酰-S-载体复合物；3)分别携带有氨酰基和肽酰基的载体与C结构域上的特定区域结合，形成新肽键，产生延长了一个氨基酸的新的肽键-S-载体复合物和游离的载体。在上述基本结构域的基础上，有些模块还存在一些修饰结构域，通常与基本结构域毗邻，对氨基酸残基进行进一步修饰。如，差向异构化结构域(Epimerization，E)催化L-型的氨基酸转化为D-型氨基酸，甲基转移酶结构域(methyltransferase domain，M)。在合成酶系NRPSs的最后一个模块包含一个硫酯酶结构域(Thioesterase domain，TE)，该结构域负责脂肽类化合物的环化和从复合酶上的释放。脂肽类的化合物的肽序列和催化模块的排列之间存在线性关系，即模块的数量、种类和排列的空间顺序决定了相应脂肽类化合物肽序列的氨基酸残个数、种类和顺序。这种具有共线性结构域的NRPSs成为线性NRPSs(A型)。目前也发现一些偏离经典的共线性结构体系的NRPSs，如重复性NRPSs(B型)和非线性NRPSs(C型)。