[发明专利]一种菌种保藏方法

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种在超低温冷冻条件下，保护菌种稳定性及其代谢活性的保藏方法。 

背景技术

工业生产中常用的几种菌种保藏方法包括：定期移植法、液体石蜡油保藏法、沙土管保藏法、冷冻真空干燥法、液氮超低温冻结法、-80℃低温冷冻保藏等待。这些菌种保藏方法各有其优点和缺点。例如定期移植法，斜面在保藏期间培养基的水分易于蒸发而收缩、干涸、塌陷，使其浓度增高，渗透压加大，因而会引起菌种退化甚至死亡；连续传代后一些有利性状会减弱；易造成杂菌污染。液体石蜡油保藏法：石蜡油多为化学纯，若含有杂质，尤其是有毒物质，应用于菌种保藏则会影响菌种的生产性能；在保藏过程中石蜡油会因为蒸发减少，而致使斜面培养物露出，若不及时补加，会引起菌种退化甚至死亡；保藏的斜面须直立放置，占据的储存空间太大，对储存设备需量大。沙土管保藏法：保藏载体之一的土，要取于贫瘠土，取材存在要求高；沙、土需要洗涤、除杂、除铁屑；沙土管中沙土的比例不固定，受沙土质量和菌种特性所影响，往往需要通过试验而定；存活率低、变异率高。冷冻真空干燥法：对设备的要求高，制备耗时长，对操作人员的技能要求高。液态氮超低温冻结法：需要先慢速冷冻至-40℃，然后再放入液氮罐内速冷至-150℃进行保存；操作相对繁琐，对设备要求也高。 

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种操作方便、简单易行、可操作性高、生物安全性高、保存效能高、保藏成本低的菌种保藏方法。 

为实现上述发明目的所采取的技术方案为： 

本着单一保护剂不能满足菌体抵抗外界恶劣条件的客观情况，本发明所提供的液体菌种的保藏方法是： 

1、冷冻保护剂的制备：按终浓度分别配制10%甘油和2%海藻糖溶液。经119～121℃、30min灭菌，得到冷冻保护剂。 

2、将菌种与复合冷冻保护剂混合后，用冻存管分装好后放入100孔冻存管盒内，盒盖上做好标记，置于-80℃冰箱内直接一步冻存。 

3、复苏操作时，从冰箱中取出制品，立即放置35℃-40℃水浴中快速摇动复苏，使得内部结冰全部溶解为止。 

采用本发明的保藏方法，在现有超低温保藏技术的方法上，大大降低了保藏成本，无需购买专用设备，所用冷冻保护剂价廉易采购，冻存管制备程序简单、耗时短。存活率高、纯度高、传代5代内稳定性好。 

与单一采用高浓度甘油做保护剂相比，有以下优点：能消除悬浮在保护剂中的菌样的不均匀状态；能确保制品的质量；给传代生长创造了良好的环境。保证了蛋白质的稳定性。冷冻保存过程中无需实施程序降温，查找与复苏操作方便。 

具体实施方式

1、用种液做菌种保藏的流程： 

生产菌株冻存管→活化一代→活化二代→活化三代→自然选育→摇瓶初筛、复筛→性能优良菌种保藏 

2、用斜面孢子做菌种保藏的流程： 

生产菌株冻存管→分离平板→制备斜面→自然选育→种子液制备→发酵液接种→摇瓶初筛、复筛→性能优良斜面保藏 

3、用纯化的单菌落做菌种保藏的流程： 

生产菌株斜面→自然选育→分离平板→单菌落一对一点种→性能优良单菌落保藏。 

实施例 

冷冻保护剂的制备：按终浓度分别配制10%甘油和2%海藻糖溶液。经119～121℃、30min灭菌，得到冷冻保护剂。 

1、种液做菌种保藏 

1.1接种液体培养基，恒温振荡培养后，用刻度吸管精确吸取菌悬液1ml～2ml入耐高温、冷冻离心管内，经8000～10000rpm/min高速离心，弃去上清液，补加1ml～2ml冷冻保护剂，在漩涡混合器上使之与菌体充分混匀。 

1.2冻存管菌种的保存：将上述分装好菌液的冻存管放入100孔冻存管盒内，盒盖上做好标记，置于-80℃超低温冰箱内保存。 

1.3冻存管菌种的恢复培养：保藏的菌种取用时，将按照冻存盒盒盖上的标记可快速查找到所需的冻存管菌种。冻存管取出后，立即放入35～40℃的水浴中进行快速、震荡解冻，直到全部融化为止。 在无菌操净台下打开冻存管，将内容物移入适宜的培养基上培养。 

2、斜面孢子做菌种保藏