[发明专利]经过优化的非规范锌指蛋白

权利要求书

1.一种锌指蛋白，其包含多个锌指，其中至少一个锌指是非规范锌指，所述非规范锌指具有牵涉DNA结合的螺旋部分且包含序列Cys-(X^A)_2-4-Cys-(X^B)₁₂-His-(X^C)_3-5-Cys-(X^D)_l-10，其中X^A、X^B、X^C和X^D可以是任何氨基酸，且其中His-(X^C)_3-5-Cys-(X^D)_l-10为SEQ IDNO:21、23-24、33、38-40、51-53、64、71、75-79、83-87、91或92中任一所示的序列，且其中所述锌指蛋白被改造成结合DNA中的靶序列。

2.权利要求1的锌指蛋白，其中所述锌指蛋白被改造成结合IPP2-K基因中的靶序列且包含F1至F4、F1至F5或F1至F6次序的4个、5个或6个锌指结构域，其中每个锌指结构域包含识别螺旋区，且其中所述锌指蛋白包含下表单行所示次序的识别螺旋：

3.一种融合蛋白，其包含权利要求1至2任一项的锌指蛋白和一个或多个功能域。

4.权利要求3的融合蛋白，其中所述功能域包含切割半结构域，且其中所述融合蛋白包含插入所述切割半结构域和所述锌指蛋白之间的接头。

5.权利要求4的融合蛋白，其中所述接头的长度是5或6个氨基酸。

6.一种多核苷酸，其编码至少一种依照权利要求1至2任一项的锌指蛋白或依照权利要求3至5任一项的融合蛋白。

7.一种用于在植物细胞中靶向切割细胞染色质的方法，所述方法包括在所述细胞中表达一对依照权利要求4的融合蛋白或至少一种编码所述一对融合蛋白的多核苷酸，其中：

(a)所述融合蛋白的靶序列彼此相距10个核苷酸之内；且

(b)所述融合蛋白二聚化并切割位于所述靶序列之间的DNA。

8.一种在宿主植物细胞中靶向遗传重组的方法，所述方法包括：

(a)在所述宿主细胞中表达一对依照权利要求4的融合蛋白或至少一种编码所述一对融合蛋白的多核苷酸，其中所述融合蛋白的靶序列存在于选定的宿主靶基因座中；并

(b)鉴定在所述宿主靶基因座中展现出序列改变的重组宿主细胞；并

(c)任选将外源多核苷酸导入所述宿主细胞中，其中所述外源多核苷酸在存在时整合至所述宿主植物细胞的基因组中。

9.权利要求8的方法，其中所述序列改变是选自下组的突变：遗传物质的删除、遗传物质的插入、遗传物质的替代及其任何组合。

10.一种用于降低植物种子中植酸水平或使磷在植物种子中更能被代谢利用的方法，所述方法包括通过依照权利要求8的方法灭活或改变IPP2-K基因。