[发明专利]一种甘精胰岛素前体蛋白的提取方法

说明书

本申请要求于2012年11月21日提交中国专利局、申请号为201210475070.3、发明名称为“一种甘精胰岛素前体蛋白的提取方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体的说是涉及一种甘精胰岛素前体蛋白的提取方法。

背景技术

在糖尿病治疗中，胰岛素对控制血糖达标、预防并发症具有不可替代的作用，是目前最为有效的糖尿病治疗手段之一。近年来，随着胰岛素技术的发展，开发出了胰岛素类似物。其中一种长效胰岛素类似物-甘精胰岛素，正在被越来越多的医生和患者接受和使用。

甘精胰岛素是一种利用重组DNA技术生产的生物合成人胰岛素类似物。它是在人胰岛素B链羧基末端增加了两个精氨酸，同时也把A链羧基末端A21位置的天冬酰胺替换成甘氨酸，皮下注射后，因酸性溶液被中和而形成的微小沉淀可持续缓慢释放甘精胰岛素，继之吸收入血也慢，从而产生长达24小时平稳无峰值的可预见的血药浓度。因此，每天定时皮下注射一次甘精胰岛素，即可满足人体对基础胰岛素的需要，也减轻了患者要多次注射痛苦。在持续改善血糖控制的情况下，甘精胰岛素可降低低血糖症发生率。

制备甘精胰岛素的方法通常是利用基因工程技术将甘精胰岛素前体基因连接到表达载体上，然后转化到微生物菌表达系统进行发酵生产甘精胰岛素前体蛋白，而后菌体分离提取前体蛋白并酶切处理获得甘精胰岛素。目前常见的微生物表达系统有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。大肠杆菌表达系统产物多为包涵体，相比之下，酵母表达系统无需包涵体变复性的繁琐及高消耗操作步骤，而且酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉价，表达的外源蛋白可分泌到胞外，内源蛋白分泌较少，利于外源蛋白的分离和纯化。

提取甘精胰岛素前体蛋白是生产甘精胰岛素不可缺少的步骤，现阶段提取甘精胰岛素前体蛋白一般是将发酵液不经预处理，直接离心后收集上清液，菌体被废弃。但是由于目的蛋白性质不同，有部分的目的蛋白可能存在于废弃菌体中，直接废弃将导致获得的目的产物量大大降低。因此，对特定的目的蛋白发酵液进行预处理，有利于提高产量。发酵液预处理方式有温度调节、pH调节、絮凝与凝聚等，但大多都用于抗生素预处理，主要目的是提高过滤效果等。以调节pH值为例，现有报道如US6218385发酵液加酸的目的是失活发酵后余留的微生物，防止肉汤自溶和维持相对低的肉汤粘度；CN200610011694.4发酵液加酸的目的是处理细菌的荚膜方便过滤；CN200710026682.3发酵液加酸的目的是使目的蛋白不被活性炭吸附；CN200810233835.6发酵液加酸的目的是防止谷胱甘肽被氧化；CN200910222792.6是发酵离心后得沉淀稀释加酸辅助溶解纳他霉素，但是上述报道中均未涉及甘精胰岛素前体蛋白发酵液，而且其加酸的出发点也不是提高蛋白含量。同时人胰岛素前体发酵液在离心前经过酸化处理后，其前体蛋白的回收率并没有明显提高。此外，其他预处理发酵液的报道也并未涉及甘精胰岛素前体蛋白含量的提高。

由此可以看出，现有技术中关于如何在提取过程中提高甘精胰岛素前体蛋白含量的报道几乎没有。因此，在胰岛素生产领域需要提供一种能够增加甘精胰岛素前体蛋白含量的提取方法，从而提高甘精胰岛素的生产效率。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甘精胰岛素前体蛋白的提取方法，使得该提取方法能够提高甘精胰岛素前体蛋白的含量。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种甘精胰岛素前体蛋白的提取方法，将甘精胰岛素前体蛋白发酵液加酸调节pH值为1-4，而后离心取上清液即得甘精胰岛素前体蛋白。

本发明申请人针对现有直接离心去除菌体提取甘精胰岛素前体蛋白方法的缺陷，经过深入研究，在离心前用酸调节甘精胰岛素前体蛋白发酵液的pH值为1-4，使得发酵液中甘精胰岛素前体蛋白含量得到提高，其前体蛋白含量最多增加高达83%。

其中，作为优选，所述酸为盐酸、冰醋酸、硫酸或磷酸，更优选为盐酸、磷酸中的一种或两种以上；所述pH值优选调节为1-3，更优选调节为2。