[发明专利]表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种能够表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母，以及该重组毕赤酵母的构建方法。

背景技术

UBC13蛋白即泛素连接酶E2N(Ubiquitin-conjugating enzyme E2N,UBE2N)，其广泛存在于人体多种细胞中，如皮肤细胞、淋巴细胞等，并在这些细胞中发挥重要功能。UBC13蛋白的主要生物学功能包括以下方面：1、UBC13的异二聚体UBE2V1-UBE2N和UBE2V2-UBE2N 可以催化合成非正规的赖氨酸- 63的多聚泛素链，这种类型的多聚泛素化不会使蛋白酶体降解蛋白质；2、UBC13调节目的基因的转录活性，且在细胞周期和分化过程中起调节作用；3、UBC13在无错误的DNA修复途径中起调节作用，对DNA损伤后的细胞生存起一定的作用；4、UBC13对调节性T淋巴细胞的活性起重要作用，从而影响免疫活动；等等。

毕赤酵母表达系统具有表达量高、蛋白表达后可修饰、易规模化生产、成产成本较低、外源蛋白基因遗传性稳定等特点，已有多种外源蛋白基因在毕赤酵母中表达。毕赤酵母基因表达系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点：1、具有调控机理严格的醇氧化酶AOX1基因启动子；2、表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或者多拷贝的形式稳定结合；3、酵母菌株能进行高密度发酵，且外援表达产量高。

目前国内外尚未见到利用毕赤酵母表达UBC13蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达UBC13蛋白的毕赤酵母及其构建方法。

本发明所提供的表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母，是由携带有UBC13蛋白的重组表达载体转化的毕赤酵母，其中，所述重组表达载体中包含有SEQ ID NO.1所示的UBC13蛋白的核苷酸序列。

其中，所述UBC13蛋白的基因来源于人。

毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性，获得包括美国FDA在内的广泛认可。它能够对外源蛋白进行翻译后加工，使之更接近于天然蛋白的构象和活性，是一种广泛应用的真核表达系统。本发明所述毕赤酵母具体为毕赤酵母X33。

本发明所述的重组表达载体使用的载体为pwPICZalpha质粒载体。

本发明的另一目的是提供一种构建所述重组毕赤酵母的方法，包括如下步骤：

1)人工合成UBC13蛋白基因；

2)在质粒载体的多克隆位点插入UBC13蛋白基因，构建重组表达载体；

3)将所述重组表达载体导入毕赤酵母中，获得表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母。

其中，所述毕赤酵母为毕赤酵母X33，所述重组表达载体使用pwPICZalpha质粒载体。本发明构建的表达UBC13蛋白的毕赤酵母命名为毕赤酵母X33/pwPICZalpha/UBC13。

本发明所述的重组毕赤酵母可用来生产UBC13蛋白。

本发明首次在毕赤酵母表达系统中分泌表达了人UBC13蛋白，分泌表达无需破碎细胞切培养基中杂蛋白含量极低，纯化步骤简单，适宜工业化生产。毕赤酵母适用于工业规模的高密度发酵，培养基廉价，操作简单，产物具有很好的生物安全性，适用于生活用品、食品和医药等领域。

附图说明

图1为XhoⅠ和BcoRⅠ酶切鉴定人工合成的含UBC13蛋白基因的重组质粒。

图2为XhoⅠ和BcoRⅠ酶切鉴定含UBC13蛋白基因的pwPICZalpha重组表达质粒。

图3为重组酵母表达后培养基上清液及上清液第一步纯化(过镍柱)后的SDS-PAGE电泳检测结果。

图4为上清液第二步纯化(过阴离子交换柱)后的SDS-PAGE电泳检测结果。

图5为UBC13蛋白浓缩后保存前的SDS-PAGE电泳检测结果。

具体实施方法

实施例1：携带有UBC13蛋白基因的重组表达载体的构建。

1、根据毕赤酵母对密码子的偏好性，人工设计UBC13蛋白基因，并在碳端添加酶切位点XhoⅠ，氮端添加酶切位点EcoRⅠ，交与相关公司合成。人工设计的UBC13蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2、将含有合成的目的基因质粒的大肠杆菌在含0.1%氨苄的LB液体培养基中培养。