[发明专利]病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法，属于生物技术领域。 

背景技术

核酸诊断技术是对新城疫病毒进行确诊最有效的手段，目前主要采用普通RT-PCR和荧光RT-PCR技术，普通RT-PCR方法虽能够对新城疫病毒进行检测,但存在检测过程繁琐、易造成假阳性、假阴性、污染严重等问题；实时荧光RT-PCR技术以重复性好、灵敏度高、特异性强、操作简单、所需时间短、无污染等优点被广泛应用于各种病原的快速检测。因荧光RT-PCR检测技术要求高，试剂容易失效，加上检测新城疫所用双拭子或组织样本成分复杂，一些样本中可能含有抑制RT-PCR扩增的物质，造成检测结果出现假阴性，采用病毒样颗粒内标监控整个实验过程，能有效控制假阴性结果的出现。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法。 

本发明是通过以下技术方案来实现的。 

一种病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法，根据新城疫病毒基因序列，在6997到7092之间的位点设计特异性引 物和TaqMan探针；根据扩增目标片段的特点，设计内标探针序列。 

上述特异性引物的上游引物序列为：tgcagagatc actcacactc at 

上述特异性引物的下游引物序列为：gatggaacgc agagtagaaa ag 

上述TaqMan探针的目标探针序列为：FAM-cctgttgcag atgtccggagcac-BHQ1; 

上述TaqMan探针的内标探针序列为：VIC-gctcattcgg ctcgacgggcaat-BHQ2。 

通过人工合成、克隆、表达过程制备了监控提取和反应的病毒样颗粒内标，所制备的内标序列包含新城疫引物识别序列和特有的内标探针识别序列，内标荧光报告基团用VIC标记，可对检测进行全过程监控，有效防止假阴性出现。 

本发明的有益效果：本发明提供了一种快速、特异性强、灵敏度高、能监控整个检测过程的新城疫检测方法，应用于临床，能在3小时内准确的对新城疫进行诊断，为动物疫病治疗方案的制定提供依据，提高科学养殖水平。 

具体实施方式

下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。 

实施案例： 

具体设计与操作步骤： 

1、检测用引物与探针的设计 

根据新城疫基因全序列，设计上、下游引物和目标探针序列；根据目标探针序列，设计内标探针序列如下：特异性引物的上游引物序 列为：tgcagagatc actcacactc at 

特异性引物的下游引物序列为：gatggaacgc agagtagaaa ag 

TaqMan探针的目标探针序列为：FAM-cctgttgcag atgtccggagcac-BHQ1; 

TaqMan探针的内标探针序列为：VIC-gctcattcgg ctcgacgggcaat-BHQ2。 

2、病毒样颗粒内标的制备 

（1）MS2噬菌体包裹蛋白基因片段的扩增。MS2上游引物序列为：atggatcctg ggaccccttt cggggtcctg ct,MS2下游引物序列为：gcaagctttc aatacataaa gagttgaact tct,扩增片段长度为1798bp，引物首尾分别含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。以MS2噬菌体RNA为模板，一步法RT-PCR扩增,扩增产物分别用琼脂糖凝胶电泳和双酶切鉴定。 

（2）PET-32a-MS2重组质粒的构建。将以上扩增产物纯化,纯化产物和PET-32a载体双酶切后，再用DNase Ligase连接，转化大肠杆菌BL21，采用双酶切和PCR筛选阳性质粒，获得重组质粒PET-32a-MS2。